多种途径诱生抑制性树突状细胞及其产生免疫抑制的机制研究

【摘要】第一部分CD80/CD86基因RNA干扰慢病毒载体诱生抑制性树突状细胞及其产生免疫抑制的研究目的：本实验旨在研究经RNA干扰后,受者来源的抑制性树突状细胞(Dentriticcell,DC)在间接识别通路中产生免疫抑制活性的相关机制。方法：在受者C3H小鼠骨髓来源DC培养过程中,加入供者C57BL/6小鼠脾脏来源的抗原,通过CD80/CD86基因RNA干扰慢病毒感染负载供者抗原的受者DC。通过流式细胞技术检测其表面分子CD80和CD86的表达情况。并将该DC与C3H小鼠脾脏T细胞进行混合淋巴细胞反应(Mixedlymphocytereaction,MLR),检测T细胞增殖情况。通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测MLR上清液中的细胞因子IL-2,IL-4,IL-10及干扰素γ(Interferon-γ,INF-γ)的表达水平。通过AnnexinV/CD3双染色法检测间接识别通路中T细胞的凋亡情况。结果：相较对照组及空白组而言,CD80/CD86基因RNA干扰慢病毒感染组可明显抑制DC表面共刺激分子CD80和CD86的表达(P<0.05),并可以得到稳定的抑制性DC。在MLR中,使用慢病毒处理受者DC能够有效减弱对受者T细胞增殖的刺激作用。ELISA结果提示,培养上清中Thl细胞因子(IL-2和INF-γ)的含量明显减少,而Th2细胞因子(IL-10)的含量显著增高(P<0.05),IL-4表达水平无明显差异(P>0.05)。并且发现抑制性DC可以显著诱导T细胞凋亡(P<0.05)。结论：慢病毒载体介导的RNA干扰方法可以有效诱导CD80及CD86低表达的抑制性DC的生成。这种抑制性DC可以通过诱导T细胞凋亡的方式产生重要的免疫抑制活性。第二部分肝星状细胞诱生抑制性树突状细胞及其产生免疫抑制的研究目的：研究INF-γ促进肝星状细胞(Hepaticstellatecell,HSC)表达B7-H1及其相关信号通路,进一步研究HSC诱生抑制性DC并产生免疫抑制的相关机制。方法：在INF-γ活化C57BL/6小鼠HSC的过程中,我们将不同浓度的INF-γ作用于HSC,将恒定浓度的INF-γ与HSC作用0.5-48hrs。同时,利用INF-γ刺激INF-γR1基因敲除及Statl基因敲除小鼠的HSC。在此HSC活化过程中,还加入蛋白合成抑制剂(CHX)、RNA合成抑制剂(ActD)及信号通路抑制剂(U0126、SP600125和LY294002),分别利用流式细胞仪及RT-PCR检测INF-γ促进HSC表达B7-H1情况。通过Westernblot检测HSC中ERKl/2磷酸化情况。在C57BL/6小鼠骨髓来源DC培养过程中,加入活化的C57BL/6小鼠HSC。通过流式细胞技术检测DC表面分子CD80和CD86的表达情况。将该DC与BALB/c小鼠脾脏T细胞进行MLR,检测T细胞增殖情况。通过AnnexinV/CD3双染色法检测MLR中T细胞凋亡的情况。结果：经INF-γ活化后,HSC表达B7-H1显著增加,且和INF-γ活化时间及浓度成正相关。INF-γR1及Stat1基因敲除小鼠来源的HSC经INF-γ活化后几乎不表达B7-H1。ActD可以阻断B7-H1mRNA的合成,而CHX对B7-H1mRNA的合成无影响。阻断P13K信号通路抑制剂LY294002对INF-γ活化HSC促进B7-H1的表达无影响,而阻断MEK1/2信号通路抑制剂U0126可以显著抑制B7-H1的表达。阻断JNK信号通路抑制剂SP600125可轻度减少B7-H1的表达。Westernblot检测发现,经INF-γ活化的HSCs中ERK1/2发生磷酸化。激活后的HSC可以抑制DC表面分子CD80和CD86的表达。在MLR中,经活化的HSC处理的DC能够有效减弱对T细胞增殖的刺激作用。并且发现这些抑制性DC可以显著诱导T细胞凋亡。结论：INF-y通过MEK/ERK信号通路促进HSC高表达B7-H1。经INF-y活化的HSC可诱导抑制性DC生成,且此抑制性DC可通过诱导T细胞凋亡参与免疫抑制。
【作者】洪军；
【导师】陈宗祐；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】抑制性树突状细胞；RNA干扰；肝脏星状细胞；T细胞凋亡；免疫抑制；

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