肿瘤相关基因启动子甲基化和人脑胶质瘤临床预后相关性研究

【摘要】神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,如何进一步了解肿瘤发病的机理,为治疗脑胶质瘤探索新的思路和方法,以改善脑胶质瘤患者的生存率及生存质量,这一直是医学面临的难题。表观遗传学指研究不引起基因序列改变,但可以影响基因表达的可遗传性改变,其中DNA甲基化是人类最为常见的表观遗传改变,胶质瘤中也存在不同形式的异常甲基化,包括全基因组低甲基化,启动子CpG岛高甲基化,这些改变可能导致癌基因的活化和/或抑癌基因的表达沉默而最终形成肿瘤。本课题旨在研究与神经胶质瘤相关的部分肿瘤基因启动子区甲基化状态与肿瘤患者临床预后的相关性以及对甲基化状态检测方法的探究,以期找到一种适合于临床应用的检测方法,对脑胶质瘤早期诊断、复发监测、预后评判、个体化治疗方案的选择以及进一步行分子生物学治疗提供理论依据。第一部分人脑胶质瘤MGMT启动子甲基化检测方法的研究实验目的巢式MSP是目前研究MGMT启动子甲基化的方法中比较成熟的种,并已用巢式MSP法建立了MGMT启动子甲基化状态的预测价值。本实验中,我们用一种灵敏且高通量的实时荧光定量的方法(MethyLight)来检测胶质瘤MGMT启动子甲基化状态,对比分析MethyLight和巢式MSP两种方法在检测胶质瘤MGMT启动子甲基化中的效度和信度。实验方法收集54例人脑胶质瘤和2例外伤脑组织手术切除新鲜样本,用改良碱裂解法提取样本基因组DNA,并对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰,然后分别用巢式MSP和MethyLight两种方法检测样本中MGMT启动子甲基化状态,并对检测结果进行分析比较。实验结果MethyLight法样本复孔间有良好的重复性,Pearson相关系数可达0.908。两种检测方法结果有很好的一致性(48/56,85.7%)。我们以临床检验已经证实的巢式MSP方法为检测标准,所获得的MethyLight法的灵敏度和特异度分别是84%(21/25)和87%(27/31),阳性和阴性预测值分别是84%(21/25)和87%(27/31)。实验结论MethyLight是一种敏感且高通量的实时定量甲基化检测方法,能够用于胶质瘤MGMT启动子甲基化的检测,该方法与巢式MSP法的检测结果之间有良好的一致性和重复性。第二部分人脑胶质母细胞瘤MGMT启动子甲基化及蛋白表达和临床预后相关性研究实验目的MGMT启动子甲基化已经作为生物标志物用于判断胶质瘤患者对药物治疗的敏感性和预后评估。但MGMT启动子的甲基化状况及其在脑胶质瘤组织中的表达水平与患者的生存预后之间的关系尚有争议。本研究旨在检测胶质瘤中MGMT启动子甲基化状况及肿瘤组织中MGMT蛋白表达水平,并将检测结果与患者临床预后作相关性分析。实验方法收集119例人脑胶质母细胞瘤和10例外伤脑组织石蜡包埋样本,用改良碱裂解法提取样本基因组DNA,并对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰,然后用MethyLight法检测样本中MGMT启动子甲基化状态,部分样本用来进行免疫组织化学染色,检测MGMT蛋白表达水平,然后对MGMT启动子甲基化状态、MGMT表达水平及患者预后进行相关性分析。实验结果在119例胶质母细胞瘤样本中,有42例发生了MGMT启动子甲基化(M+),甲基化发生率是35.3%(42/119),而其余77例未发生甲基化(M-)。多因素分析发现MGMT启动子甲基化状态是独立于患者年龄、手术切除范围和增值指数(MIB-1)之外的影响患者预后的重要因素,MGMT启动子甲基化与无进展生存期(PFS)和总体生存期(OS)延长相关。MGMT免疫组化结果显示,MGMT的表达水平在肿瘤样本中存在很大差异。分析结果显示,经免疫组化染色法测得的MGMT蛋白表达水平和患者临床预后之间没有相关性(P>0.05),且与MGMT启动子甲基化状态之间也不存在相关性(P>0.05)。实验结论MGMT启动子甲基化状态与胶质母细胞瘤患者生存紧密相关,免疫组化染色法测得的MGMT表达水平与患者预后及启动子甲基化之间缺乏关联性,相比之下,MGMT启动子甲基化状态能够更加准确地反应患者临床预后。第三部分人脑胶质瘤CD133启动子甲基化及蛋白表达和临床预后相关性研究实验目的CD133在脑肿瘤干细胞的鉴定和分离中发挥着重要的作用,但是CD133启动子的甲基化状况及其在脑肿瘤组织中的表达水平与患者的生存期之间的关系还不是十分清楚。本研究旨在检测胶质瘤中CD133启动子1-3区的甲基化状态及肿瘤组织中CD133的蛋白表达水平,并将检测结果与患者预后情况作相关性分析。实验方法收集170例人脑胶质瘤和3例外伤脑组织石蜡包埋样本,用改良碱裂解法提取样本基因组DNA,并对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰,然后用巢式MSP法检测样本中CD133启动子甲基化状态,部分样本进行免疫组织化学染色,检测CD133蛋白表达水平,然后对CD133启动子甲基化状态,CD133蛋白表达水平及患者预后进行相关性分析。实验结果在170例胶质瘤样本中我们共检测到了5种CD133启动子甲基化状态：仅有甲基化(M+,U-)36例,高甲基化和低未甲基化(M+,U1)23例,甲基化和未甲基化均等(M+,U+)40例,低甲基化和高未甲基化(M1,U+)7例,仅有未甲基化(M-,U+)64例。多因素分析发现CD133启动子甲基化状态是独立于肿瘤分级、手术切除范围和患者年龄之外的影响患者预后的重要因素,CD133启动子甲基化与患者无进展生存期和总体生存期延长相关。CD133免疫组化结果显示,CD133的表达水平在胶质瘤样本中存在很大变异。分析结果显示,经免疫组化染色法测得的CD133蛋白表达水平和患者预后之间没有相关性(P>0.05),且与CD133启动子甲基化状态之间也不存在相关性(Kw=-0.165)。实验结论CD133启动子甲基化与患者无进展生存期和总体生存期延长相关,免疫组化法测得的CD133蛋白表达水平和患者预后及CD133启动子甲基化状态之间缺乏相关性,CD133启动子甲基化状态有望成为脑胶质瘤预后判断的分子标志物。
【作者】陈功；
【导师】毛颖；
【作者基本信息】复旦大学，神经外科学，2013，博士
【关键词】胶质瘤；DNA甲基化；预后；O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；CD133；

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