MicroRNA-145通过介导OPG表达参与糖尿病慢性炎症过程

【摘要】第一部分糖尿病人群外周血单个核细胞中miR-145的表达差异研究目的：分析2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-145以及外周血清中OPG的差异表达。方法：应用口服糖耐量实验社区筛查新诊断的2型糖尿病、IGT患者以及性别年龄相匹配的正常人群作为对照组,抽取外周血。应用RealTimePCR的方式抽取外周血单个核细胞中的miR-145；应用westernblotting检测血清中OPG表达；应用线性回归法分析miR-145和OPG的表达相关性。结果：1、2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-145的表达下调；2、2型糖尿病患者外周血清中OPG表达上调；3、miR-145的表达和OPG的表达呈现负向相关关系。结论：2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-145表达下调,外周血清中OPG表达上调。第二部分miR-145慢病毒表达载体的构建与鉴定目的：构建及鉴定miR-145慢病毒表达载体,包装纯化慢病毒颗粒,检测慢病毒体外感染的表达情况及效率。方法：利用RealTimePCR的方法,合成miR-145序列,克隆到载体中,并利用载体引物进行测序；取PCR鉴定阳性的克隆,用QIAGENplasmidminikit提质粒,对含目的片段的阳性重组克隆进行全序列测定,并对测序结果使用NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)数据库进行序列比对；对表达载体进行线性化处理：双酶切表达载体质粒DNA,切胶回收酶切产物以及对酶切产物进行浓度纯度鉴定；将重组质粒和包装质粒共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞后包装出高滴度的慢病毒颗粒。使用经过滴度检测的慢病毒,进行细胞感染预实验,求得最佳的病毒感染复数(MOI)值。将携带miR-145的融合EGFP基因的重组慢病毒再次感染293T细胞,检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白和应用RealTime-PCR检测miR-145的表达量以及应用Westernblotting检测miR-145的靶基因OPG的表达,进一步验证重组慢病毒在细胞中的表达。结果：1、从小鼠胚胎细胞NIH3T3中提取总DNA,琼脂糖凝胶电泳见基因组DNA条带清晰,无明显降解确。经PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳,可见606bp大小的阳性条带。菌落PCR扩增后电泳,可见目的条带(689bp)长度所处位置正确。提取质粒进行测序,测序结果与miR-145的小鼠基因组标准序列完全一致；2、重组质粒经酶切鉴定,测序结果显示插入序列与目标标准序列一致；重组质粒中携带有正确的miR-145,并能转染293T细胞,产生重组病毒,经纯化浓缩后慢病毒滴度高达1.9×104ifu/ul;3、目的基因miR-145能被重组慢病毒高效地转染入293T细胞后24小时即可见到绿色荧光蛋白表达,以后逐渐增强,72小时可见到较强的EGFP表达,之后表达趋于稳定；4、检测被感染的293T细胞,结果显示以慢病毒为载体过表达miR-145组细胞内miR-145含量较对照组明显升高,且这一组细胞中OPG含量明显下降,并且在72、96以及120小时等时间点水平无明显差异,说明病毒的转染是高效、持久而且稳定的。结论：过表达miR-145的慢病毒载体稳定、高效,能够用于后续的实验研究。第三部分miR-145参与调控糖尿病及动脉粥样硬化中的炎症进程目的：明确miR-145参与调控糖尿病及动脉粥样硬化疾病的代谢性炎症过程。方法：应用慢病毒为载体过表达miR-145,通过尾静脉注射方式注射糖尿病模型小鼠db/db及动脉粥样硬化模型小鼠apoE-/-体内。Db/db小鼠正常饮食喂养,每周监测两次体重、血糖；apoE-/-小鼠高脂饮食喂养,每周监测两次血压。小鼠处死后,应用RealTimePCR检测小鼠血清中miR-145含量；应用ELISA法检测小鼠血清中OPG表达；应用westernblotting方法检测(1b/db鼠肝脏、肾脏、血管以及小鼠的血管中OPG表达；apoE-/-法检测qRT-PCR两种小鼠模型血清中以及MCP-1的TNF-α、IL-lb、IL-6、IL-10水平；mRNA分别取两种小鼠各100ul血清进行炎症因子芯片筛查,根据筛查结果选取以及MCP-1进行进一步的血清IL-10、IL-lb检测；ELISA、鼠肝脏HEdb/db染色以及免疫组化检测；取小鼠的主动脉进行油红O染色。apoE-/-结果：1、过表达miR-145组小鼠相比于对照组体重减轻、空腹血糖下降、进食量db/db下降以及出现明显的糖耐量改善；2、过表达miR-145组小鼠舒张压及收缩压都较对照组下降,具有统计学意apoE-/-义；过表达miR-145组小鼠主动脉粥样斑块显著降低；apoE-/-3、两种动物模型小鼠中,过表达了miR-145后,其血清miR-145水平显著上调,OPG水平显著下调；小鼠的肝脏、肾脏及血管中OPG表达降低；db/db小鼠血管中OPG表达降低。apoE-/-4、两种小鼠血清等五种主要炎症因子的TNF-α水平下调；血清IL-10、mRNAIL-1b以及MCP-1表达下调。5、体外实验中,miR-145能明显抑制脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞THP-1及U937分泌炎症因子结论：miR-145在体内和体外均具有强大的抗炎作用,并通过此作用缓解糖尿病TNF-α。及动脉粥样硬化疾病中的代谢性炎症。
【作者】叶子；
【导师】胡仁明；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】2型糖尿病；miR-145；OPG；慢病毒载体；过表达；代谢性炎症；

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