糖皮质激素通过钝化细胞衰老分泌表型诱导肺癌化疗耐药的作用研究

【摘要】肺癌的发病率和死亡率仍逐年增高,其中非小细胞肺癌(Non-Small-CellLungCancer,NSCLC)占肺癌发病总数的85%,且约50%以上的患者在诊断时已处于进展期。培美曲塞(Pemetrexed,PEM)是一种多靶点抗叶酸药,可抑制多种叶酸依赖性酶和DNA合成而发挥抗肿瘤作用。作为第三代细胞毒性化疗药物的代表,PEM联合顺铂(cisplatin,DDP)的治疗方案能显著提高患者中位生存时间(尤其是在腺癌患者中),因此也首次确立了根据NSCLC病理结果选择用药的方式；且因PEM毒副作用小,病人耐受性好,目前在晚期NSCLC患者中应用非常广泛。在临床中,通常在PEM+DDP方案化疗前1天给予地塞米松(Dexamethasone,Dex)口服连续3天,用以减少化疗副反应。但遗憾的是,部分患者应用PEM+DDP方案治疗,经过一定时间的无进展期后仍不可避免地发生了疾病的进展,这部分患者出现化疗耐药现象的机制探讨引起了极大的关注。近期一些研究表明,DEX辅助应用在肿瘤细胞毒性药物治疗过程中能够诱导肿瘤细胞对化疗药物不敏感甚至耐药。鉴于此,我们开始关注NSCLC患者在应用PEM+DDP治疗一段时间后发生的疾病进展是否在一定程度上与地塞米松的共处理相关。肺癌细胞与周围的基质细胞共同存在于一个复杂的细胞生态系统中,通过自分泌或旁分泌的方式分泌细胞因子、生长因子等进行交互对话,构成肿瘤特定的微环境。化疗药物疗效的改变往往与其所处的微环境密切相关。肺癌微环境的改变可能参与了药物反应的调节和肿瘤耐药的发生。抗肿瘤药物诱导的衰老(TherapyInducedSenescence,TIS)因其能使肿瘤细胞有效地进入生长静止期且其毒性程度远远低于细胞凋亡而受到越来越多的关注。TIS无疑更有利于肺癌的慢性管理,而由衰老细胞分泌的各种细胞因子、生长因子等,即特征性的衰老相关分泌表型(SenescenceAssociatedSecretoryPhenotype,SASP),共同构成特定的肺癌微环境则会进一步影响药物的疗效。研究发现多种细胞毒性药物在治疗过程中通过引起TIS而有效地控制肿瘤的进展。因此,我们进一步需要研究PEM及DDP是否同样能够引起肺癌细胞的TIS,且DEX的共处理是否影响TIS的程度以及SASP的分泌。基于此,本研究从DEX共处理对DDP及PEM的疗效影响着手,应用体内体外实验从细胞衰老的角度研究了DEX共处理对化疗疗效的影响,发现DEX共处理通过抑制TIS引起化疗耐药,丰富了化疗耐药的机制且为临床实体肿瘤治疗提供新的思路；在对其发挥作用的具体机制研究中发现DEX共处理对DDP疗效的影响循p53依赖的方式,进一步完善了NSCLC中DEX共处理诱导化疗耐药的分子机制；在发现DEX共处理对PEM疗效影响的基础上,从SASP相关的肿瘤微环境角度阐述其机制,发现微环境改变使肿瘤细胞出现干性特征,该过程基于Bcl-2依赖方式,为临床解决DEX共处理耐药提供新的思路。第一部分非小细胞肺癌中地塞米松通过钝化p53依赖的细胞衰老诱导顺铂耐药的作用研究背景及目的：糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)(如DEX等)因其可以减轻化疗药物的副反应常作为NSCLC患者化疗过程中的辅助用药。而近期研究认为DEX联用在一些实体肿瘤中可导致多种细胞毒性药物疗效降低,其具体机制仍不甚清楚。本研究旨在观察DEX共处理在NSCLC中对DDP疗效的影响及探讨其具体机制。方法：本研究在体外应用不同的NSCLC细胞株通过检测细胞增殖、细胞形态、细胞迁移、细胞衰老等指标,观察DEX共处理对DDP疗效的影响；应用Real-timePCR、Western-blot、荧光素酶报告基因等方法从多水平检测DNA损伤通路、p53和p65等指标的表达变化,从而阐述DEX共处理影响DDP疗效的机制。在体研究中通过荷瘤裸鼠实验观察DEX对瘤体生长、生存周期等指标的影响从而观察DEX共处理对DDP疗效的影响。结果：在NSCLC细胞株中,应用DEX与DDP共处理与DDP单独处理组相比,可导致肿瘤细胞活力增加、迁移及侵袭能力增加、化疗诱导的细胞衰老受到抑制等改变。DEX共处理组肿瘤细胞显示DNA损伤信号通路蛋白表达下降、p53及下游p21CIP1表达下降、NF-κB表达下调等改变。在体研究同样发现DEX共处理可影响DDP的药物疗效。结论：本研究认为NSCLC中DEX共处理循p53依赖的方式通过抑制TIS能够降低DDP疗效导致耐药。该研究提示肺癌化疗过程中应慎重应用DEX或其他GCs进行辅助治疗。第二部分非小细胞肺癌中地塞米松通过影响肿瘤细胞衰老相关分泌表型诱导培美曲塞耐药的机制研究背景及目的：PEM作为一种多靶点抗叶酸制剂在NSCLC及胸膜间皮瘤中应用广泛。在PEM化疗过程中,DEX常作为一种重要的辅助用药推荐应用以减轻化疗药物的副反应,但DEX本身被报道可以引起化疗药物的不敏感,DEX与PEM共处理是否会引起PEM耐药目前仍不清楚。本研究拟进一步观察DEX对PEM疗效的影响及探讨具体机制。方法：建立NSCLC荷瘤裸鼠模型以及NSCLC细胞株检测模型,从动物水平和细胞水平来观察DEX共处理对PEM疗效的影响。通过炎症芯片、ELISA.Real-timePCR等方法检测细胞衰老分泌表型,观察DEX共处理对TIS及SASP的影响,并进一步通过流式细胞分析、成球培养、Western-blot.shRNA等方法来探讨其具体机制。结果：DEX共处理可以导致PEM的疗效降低,促进肿瘤的侵袭和迁移。DEX共处理可减弱PEM所致的细胞衰老样生长停止,改变肿瘤细胞衰老相关的促炎及促分裂因子分泌表型,即SASP。DEX共处理增加了NSCLC细胞的自我更新、克隆形成等能力,使部分肿瘤细胞出现干性特征。此外,在DEX共处理组Bcl-2表达增加,通过抑制剂ABT737以及shRNA来抑制Bcl-2表达可抑制肿瘤细胞生长和克隆形成能力。结论：DEX通过改变SASP抑制PEM的抗肿瘤作用,这是基于Bcl-2依赖方式的肿瘤细胞自我更新能力改变。
【作者】葛海燕；
【导师】白春学；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】地塞米松；细胞衰老；p53依赖；NF-κB；非小细胞肺癌；肿瘤细胞衰老相关表型；培美曲塞；肿瘤干细胞；

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