结直肠癌和肝转移血清蛋白诊断模型的优化和相关标志物的鉴定

【摘要】目的：应用磁珠提取血清多肽结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术建立和验证结直肠癌早期诊断模型并筛选出可早期诊断的蛋白标志物。方法：随机选取46例结直肠癌患者和35例健康人的血清,用铜离子螯合磁珠提取血清多肽后用MALDI-TOFMS检测肽质量指纹图谱,并应用统计分析软件根据不同的运算法则建立不同模型,并用另外45个肠癌血清标本和42个健康对照人群血清标本进行检测,从中选出有最佳诊断性能的模型。同时,另选取46个其他肿瘤患者的血清标本中进行验证。为进一步验证该模型的性能,另选取其他269位肠癌患者的血清和110位健康对照人群的血清对所建立的模型进行验证。对模型中的蛋白峰进一步通过串联质谱进行鉴定。结果：基于建模组和测试组的血清质谱分析,我们发现基于Fisher算法的拥有5个差异蛋白峰(m/z1778.97、1866.16、1934.65、2022.46和4588.53)的诊断模型具有最佳的判别性能。训练集的敏感度和特异度均为100%,测试集的敏感度和特异度分别为95.6%和83.3%。且该模型在诊断其他非肠癌肿瘤时,仅有54.3%(25/46)的准确性。进一步进行外源性验证时,该模型可获得94.4%(254/269)的敏感度,75.5%(83/110)的特异度和88.9%(337/379)的准确性。随后,我们进一步用串联质谱对上述蛋白峰进行鉴定,结果判定前面4个都是补体C3f的片段。结论：基于Fisher算法的拥有上述5个蛋白峰的诊断模型,能有效区分肠癌患者与健康对照组和其他肿瘤,而且该模型可能具有肠癌特异性。在该模型中,在肠癌患者中浓度明显下降的血清补体C3f,可能与肠癌的发生相关。目的：本研究拟应用质谱技术从结直肠癌伴或不伴肝转移患者血清中筛选蛋白标志物,建立相应的模型,从而有助于预测肝转移的发生。方法：选取在复旦大学附属中山医院结直肠癌专业组的手术病例,根据随访的结果将结直肠癌患者分为3类：无复发转移患者(根治术后至少3年以上无复发转移)、同时性肝转移患者(诊断肠癌时或根治术后6个月内发现肝转移)和异时性肝转移患者(根治术后6个月后发现肝转移)。本研究选取其中两类：64例异时性肝转移患者和64例无复发转移患者,随机抽取两组各40个血清样品,建立决策树模型,并用剩余的血清样品用来测试该模型的性能。并进一步将此模型中的蛋白峰通过串联质谱进行鉴定。结果：异时性肝转移和无复发转移两组患者在性别、年龄、肿瘤分布、TNM分期和组织分化程度上无显著差别。术前血清癌胚抗原(CEA)水平不能用于预测根治术后肝转移。本研究获得8个蛋白峰(m/z3315、6637、1207、1466、4167、4210、2660和4186)所建立的决策树模型能够准确区分训练集中82.5%(33/40)的无转移和80%(32/40)的异时性转移,测试集中79.2%(19/24)的无转移和70.8%(17/24)的异时性转移。决策树模型中使用的蛋白峰通过串联质谱被鉴定为甲胎蛋白的片段、补体C4A的片段、纤维蛋白原α的片段、真核肽链释放因子GTP结合亚基ERF3B的片段和血管紧张素原的片段等。结论：在本研究内性别、年龄、肿瘤分布、TNM分期和组织分化程度相匹配的患者中,包括8个蛋白峰所建立的决策树模型则可以很好地预测根治术后肝转移的发生。目的：肠癌是常见的恶性肿瘤,如果在早期发现,绝大多数患者可通过手术治疗治愈,但实际上大多患者在发现时已处于进展期,预后较差。因此,早期诊断肠癌是很迫切的需要。本研究通过组织蛋白质组学技术鉴定用于早期诊断肠癌的生物标志物。方法：收集5位病理证实为结直肠癌患者的肠癌、癌旁和正常粘膜组织,应用双向电泳技术得到双向电泳凝胶图谱,经图像分析寻找差异表达的蛋白质斑点。后将蛋白点切下经酶切,进行质谱分析,再查库进行蛋白质鉴定。然后,进一步用差异蛋白进行G0分析和pathway分析等生物信息学分析。此外,还应用WesternBlot方法从蛋白水平验证候选的蛋白标志物。结果：总计有50个蛋白质斑点在正常组与癌旁/癌组表达差异,经过质谱鉴定,得到31个可能与肠癌发生相关的差异蛋白。GeneOntology(GO)分析显示,按细胞组分分类,细胞质和线粒体的差异蛋白所占比例较大；按分子功能分类,涉及细胞结合、氧化还原酶活性、硫氧还蛋白过氧化物酶活性的比例较大：按生物学过程分类,氧化还原、抗凋亡、糖皮质激素刺激反应、脂肪代谢等所占比例较大。WesternBlot检测显示I-FABP在结直肠癌组织中表达显著下调,HSP27在结直肠癌组织中表达显著上调。结论：1.运用双向电泳结合质谱分析和生物信息学分析共筛选出31个可能与肠癌发生相关的差异蛋白。2.应用WesternBlot技术验证筛选差异表达蛋白,发现I-FABP在结直肠癌组织中表达显著下调,HSP27在结直肠癌组织中表达显著上调,有望成为潜在的标志物和治疗靶点。
【作者】朱德祥；
【导师】许剑民；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】肠癌；蛋白质组学；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；血清蛋白质指纹图谱；结直肠癌异时性肝转移；结直肠癌；双向电泳；质谱；

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