Trihydrophobin 1的酪氨酸磷酸化调控及核受体FXR在酒精性脂肪肝中的作用研究
【摘要】基因在表达翻译后形成蛋白质,其氨基酸序列不再是其功能的唯一决定因素,翻译后修饰在蛋白质结构功能成熟过程中发挥重要的调节作用。在应对外界环境因素作用下,细胞内大量的蛋白质的功能实现是通过动态的翻译后修饰来完成的。翻译后修饰的作用赋予蛋白质更加丰富信息,现已知的翻译后修饰有上百种,研究蛋白质翻译后修饰对于阐明蛋白质在维持机体正常生理过程以及预防治疗相关疾病具有重要意义。本论文中我们研究了Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化在MAPK/ERK信号转导中的效应以及核受体FXR的乙酰化在酒精性脂肪肝中的作用,初步阐明翻译后修饰在细胞正常生理过程中的复杂调控机制以及进行疾病模型中的转化研究。第一部分Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化调控研究。c-Src是一种非受体型酪氨酸激酶,在细胞增殖、存活、黏附、形态形成以及细胞迁移中都发挥关键作用。在细胞内c-Src持续活化促进细胞增殖和迁移。原癌基因c-Src的同源蛋白,v-Src,它为持续活化的激酶,并能导致肿瘤形成。已经在人类多种癌症中发现的c-Src高表达及激酶活性增高。Trihydrophobin1(TH1)基因从果蝇到人类的种属间都是高度保守,在心肌、骨骼肌、肾脏、肾上腺以及甲状腺等多种组织中广泛表达。TH1蛋白能够特异性的与MAPK/ERK信号通路的分子A-Raf相互作用,并且抑制A-Raf蛋白的激酶活性,此外,TH1还能与和PAK1相互作用对其激酶活性负调节,并且能够抑制MAPK/ERK信号传导及细胞迁移过程。TH1在乳腺癌中低表达,其表达水平与乳腺癌恶性程度成负相关,推断TH1可能是一个抑癌基因。尽管我们对TH1功能的理解已经发展,但对TH1本身的功能调节还知之甚少。本课题中,我们通过免疫共沉淀,GST-pulldown的方法鉴定了c-Src与TH1在细胞内和体外均存在相互作用,这种相互作用依赖于c-Src的活化后结构开放状态。并且内源性的c-Src与TH1也存在相互作用。通过激光共聚焦技术,我们观察到细胞内源性的c-Src与TH1在胞质内存在共定位。在细胞内及体外实验中,我们又发现c-Src能够磷酸化TH1,其酪氨酸磷酸化依赖于c-Src的激酶活性,采用c-Src的特异性抑制剂PP2几乎完全阻断了TH1酪氨酸磷酸化。通过缺失突变、点突变和生物信息学方法,我们鉴定了磷酸化位点位于TH1的第6位酪氨酸。磷酸化的TH1与A-Raf及PAK1的相互作用能力降低,进一步的实验中我们发现TH1第6位酪氨酸的磷酸化减弱其对MAPK/ERK信号转导的抑制作用,对c-Src驱动的细胞迁移的抑制作用也减弱了。TH1非磷酸化的突变体TH1(TH1-Y6F)依然能够抑制MAPK/ERK信号转导及c-Src驱动的细胞迂移,TH1模拟持续磷酸化的突变体则几乎丧失了对MAPK/ERK信号转导的抑制作用以及对细胞迁移的抑制效果。此外,我们发现EGF及雌激素刺激情况下能够诱导细胞内源性的TH1酪氨酸磷酸化。综上所述,我们推断存在c-Src通过酪氨酸磷酸化TH1进而调控Ras/Raf/MEK/ERK信号转导及细胞迁移过程机制。第二部分核受体FXR及其乙酰化在小鼠酒精性脂肪肝中的作用及相关机制研究。核受体FXR对维持肝脏正常生理功能至关重要,在糖代谢、脂代谢、胆汁酸代谢的调控起到重要作用。研究发现,FXR缺失小鼠血糖、血脂、胆固醇异常升高。活化FXR能够在胆汁淤积性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纤维化等慢性肝脏疾病中保护肝脏免受损伤。我们采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂食小鼠构建酒精性脂肪肝模型,同时采用FXR缺失小鼠以及灌胃给予小鼠FXR激动剂WAY362450处理,研究FXR在小鼠酒精性脂肪肝进展中的作用。在酒精性脂肪肝小鼠中,我们首先检测肝脏胆汁酸含量及相关代谢运输基因表达水平,发现模型小鼠肝脏存在胆汁淤积,其胆汁酸含量较对照组显著增高(33.69±4.144μmoles/glivervs.14.56±1.02μmoles/gliver,p<0.001)；胆汁酸合成限速酶CYP7A1表达量在酒精组小鼠肝脏中表达亦增高,它的表达受到FXR的负调控,胆汁酸盐输出蛋白BSEP的mRNA水平有一定程度降低,该基因受到FXR正调控。在两组小鼠肝脏内,FXRmRNA以及蛋白质水平并无明显差别,然而FXR与RXRα结合形成异二聚体的量明显减少,由于FXR发挥转录活性依赖于与RXRα的相互作用。此外在酒精性肝病小鼠中,FXR的乙酰化水平升高。FXR乙酰化会抑制其二聚化形成及转录活性,故我们推断在酒精性脂肪肝中FXR活性受到抑制。FXR缺失小鼠喂食酒精性饲料后,血清谷丙转氨酶活性较野生鼠高(111.01±15.94IU/Lvs.71.48±6.83IU/L,p<0.05),肝脏中甘油三酯含量也比野生鼠高(136.8±10.7mg/glivetvs.75.02±6.19mg/gliver,p<0.001),肝脏HE染色显示肝细胞脂肪变性和气球样变性比野生多,油红O染色显示甘油三含量较野生鼠丰富。相反,给予FXR激动剂WAY-362450处理后,能够降低血清ALT水平(92.84±9.99IU/Lvs.60.91±7.18IU/L,p<0.05)以及肝脏甘油三酯含量(110.6±7.011mg/glivetvs.57.71±8.08mg/gliver,p<0.001),而FXR缺失小鼠体内给药WAY-362450并无此效应。肝脏HE染色和油红O染色均显示WAY-362450能够降低野生型小鼠肝脏脂肪变性程度。为了研究FXR治疗酒精性脂肪肝的机制,我们首先检测了酒精代谢相关基因的表达水平,CYP2E1受酒精刺激蛋白表达水平明显上升,其mRNA水平也明显上升,若同时给予WAY-362450灌胃治疗,小鼠肝脏CYP2E1蛋白和mRNA均明显下降,酒精代谢引起的脂质过氧化产物TBARS以及4-HNE含量增高也在FXR激活后受到抑制。小鼠原代肝细胞内CYP2E1水平能被FXR激动剂WAY-362450和GW4064抑制。我们的结果首次提出酒精代谢能够影响肝脏胆汁酸代谢造成胆汁淤积,为酒精性肝损伤的另一可能机制。我们推断FXR激动剂可以作为治疗酒精性脂肪肝的潜在药物。
【作者】吴维宾；
【导师】顾建新；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2013，博士
【关键词】Trihydrophobin1；信号转导；细胞迁移；酪氨酸磷酸化；法尼酯X受体；FXR；酒精性脂肪肝；
【参考文献】
[1]汪卓妮.税收效应对我国上市公司并购行为影响的实证研究[D].广西师范大学,企业管理,2013,硕士.
[2]王生辉.一项关于英语学习策略及其与专四成绩之间相关性的研究[D].河北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[3]吴丹娜.物权请求权制度研究[D].江西财经大学,民商法学,2013,硕士.
[4]郭鸿.论慢运动休闲体育生活方式[D].湖南师范大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[5]张俊英.甘肃省装备制造业知识产权战略的制定及实施调查研究[D].兰州大学,知识产权（专业学位）,2012,硕士.
[6]常雪姣.纤维包块型胰腺炎的病理学特征及其与免疫活性细胞间的关系[D].第二军医大学,法医学,2013,硕士.
[7]陆文凯.基于离散余弦变换的地震随机噪声压制技术[J].石油地球物理勘探,2011,02:202-206+157.
[8]曹飞.动脉瘤性蛛网膜下腔出血后慢性脑积水临床分析[D].浙江大学,外科学,2004,硕士.
[9]刘晴.微信对人际传播超越的表现研究[D].河北大学,传播学,2014,硕士.
[10]高会军,王常虹.不确定连续系统的鲁棒L_2-L_∞滤波新方法(英文)[J].自动化学报,2003,06:809-814.
[11]邱洁.歌剧《白毛女》中“喜儿”的角色塑造及其主要唱段研究[D].西南大学,音乐与舞蹈学,2013,硕士.
[12]姜彩杰.手机媒介对农村社会交往方式的重构[D].安徽大学,新闻学,2013,硕士.
[13]陈晓阳.塑料排水管道几种典型破裂缺陷的研究[D].广东工业大学,市政工程,2014,硕士.
[14]李招远,丁振国.一个基于投影的Web访问序列挖掘算法[J].情报杂志,2004,08:59-60+63.
[15]李凡.数据挖掘技术的研究与应用[D].西安电子科技大学,2002.
[16]余仕湖.《新汉英词典》插图研究[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[17]丁诗瑶.基于环境行为理论的儿童医疗空间设计研究[D].湖南师范大学,设计艺术学,2014,硕士.
[18]白振强,王清华,杜庆龙,郝兰英,张善严,朱伟,于德水,王贺军.曲流河砂体三维构型地质建模及数值模拟研究[J].石油学报,2009,06:898-902+907.
[19]何立伟.股价大幅波动后的动量和反转效应研究[D].浙江工商大学,金融学,2013,硕士.
[20]郭云舒.赴泰高校汉语教师志愿者教学适应情况调查[D].吉林大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[21]朱政.白三烯D4鼻激发试验方法学的建立及其与组胺鼻激发对变应性鼻炎或合并哮喘患者气道炎症及反应性影响的比较[D].广州医科大学,呼吸内科学,2014,硕士.
[22]毛昕.教育影像资源在中小学科学素养培养中的应用研究[D].华中师范大学,2003.
[23]朱雅丽,季晨阳,乐佳清,吴俊俊,王楠,富浩轩,吴涛.酒精与肝脏脂质代谢[J].生命科学,2014,08:840-845.
[24]侯智伟.湖泊渔业生态化发展对策研究[D].中南林业科技大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[25]李屏.FHIT基因在鼻咽癌中的表达及其下调机制的研究[D].广西医科大学,临床检验诊断学,2013,硕士.
[26]史家莹.高校学生社团对大学生社会化的影响调查研究[D].山东师范大学,高等教育学,2013,硕士.
[27]詹文竹.高中语文教师课堂提问的个案研究[D].首都师范大学,学科教学,2013,硕士.
[28]赵卿漫.危机干预模式介入老年失地农民养老问题[D].吉林大学,社会工作,2013,硕士.
[29]冷德平, 章小峰, 曹 燕, 黄贞益, 张 龙, 陈 光.高Al低密度钢的高温氧化行为[J].钢铁研究学报.
[30]王乐成.连续式石墨化炉结构热应力分析与优化设计[D].东北大学,机械设计及理论,2010,硕士.
[31]许俊.基于OLAM的数据挖掘算法的分析研究[D].南京理工大学,2004.
[32]胡玮琪.丝网印刷法制备SUS430合金LSM涂层的工艺及性能研究[D].景德镇陶瓷学院,材料学,2014,硕士.
[33]衣昕.成年大鼠创伤性脑损伤后的皮质与海马内源性神经发生研究[D].苏州大学,人体解剖与组织胚胎学,2014,博士.
[34]陈卓蔓.网络舆情背景下我国服务型政府建设研究[D].湖北工业大学,政治学理论,2014,硕士.
[35]王勇.带有接收端协作的Z干扰信道的容量区域研究[D].南京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[36]舒画.人体成分与营养元素分析及其与代谢综合征的关系[D].中国人民解放军医学院,老年医学,2013,硕士.
[37]施李杨,邓连霞,杨明英,张海萍,MandalNamita,朱良均.预矿化丝素/壳聚糖复合支架的表征及细胞相容性[J].高分子材料科学与工程,2013,11:42-45.
[38]何灿.目的论视角下的汉语广告英译研究[D].东北财经大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[39]范宗良,秦晓娟,朱照琪,孙寒雪,包雪梅,安进,裴春娟.石墨烯的制备及应用研究[J].甘肃科技,2013,06:17-20.
[40]罗曼.长春市护生评判性思维能力现状调查及影响因素分析[D].吉林大学,护理学,2014,硕士.
[41]尹小兰.外来务工子女学生课外体育活动现状的分析[D].华中师范大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[42]张娅.临终关怀的伦理反思[D].西南大学,伦理学,2013,硕士.
[43]武斌.云南元江县河谷地带蚊虫及其与疾病关系调查研究[D].大理学院,病原生物学,2013,硕士.
[44]乔大军,孟祥顺,张玉斌,王晓燕.检波器的联接方式对地震资料品质的影响[J].石油地球物理勘探,2001,06:61-60+59-58+57-56+0.
[45]郭佳.“解严”以来台湾新纪录片运动发展研究[D].重庆大学,广播电视艺术学,2014,硕士.
[46]李瑞雪.高频链三相四桥臂矩阵变换器调制及控制研究[D].燕山大学,电机与电器,2014,硕士.
[47]范永康.东秦岭木头沟钼矿隐爆角砾岩筒构造形成机制的数值模拟[D].石家庄经济学院,构造地质学,2012,硕士.
[48]于凌宇.全球片式电容器面面观(之三)[J].世界产品与技术.2000(03)
[49]闫伟,张浩,陆剑峰.模糊加权关联规则在设备监控中的应用研究[J].计算机工程与应用,2005,28:4-6+77.
[50]张弛.银行卡领域商业智能的研究与应用[D].东北财经大学,2005.
