内皮祖细胞移植在脓毒症大鼠中的作用研究

【摘要】目的：探讨EPCs移植在LPS引起的大鼠sepsis中的治疗作用,探究内皮组细胞对sepsis靶向治疗的分子生物学机制提供基础实验数据。方法：采用密度梯度离心法分离SD大鼠的骨髓EPCs,接种在含20%优质胎牛血清的DMEM-F12完全培养基培养。培养5代后采用流式细胞仪鉴定表面标记物CD133、CD34的表达,免疫荧光检测内皮祖细胞特异性抗原CD133、CD34的表达。绿色荧光蛋白腺病毒转染方法进行内皮祖细胞荧光标记,活体成像仪检测及冰冻切片检测组织中标记荧光的EPCs在体内的表达。大鼠随机分为4组：正常对照组、内皮祖细胞组(EPCs组)、脓毒症模型组(LPS组)和内皮祖细胞移植治疗组(LPS+EPCs组),脓毒症模型通过LPS静脉给药诱导,EPC移植组大鼠经尾静脉注入荧光标记EPCs悬液(EPCs2×106/0.5ml)。分别于移植后1、7天取肺、肝及肾组织,采用冰冻切片检测组织中标记荧光的EPCs表达；检测各组织干/湿比值(W/D),采用HE染色评估病理改变；采用ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-10;采用Real-timePCR法检测肝、肾及肺组织TLR4的mRNA表达。结果：培养的细胞在胎牛血清DMEM培养基中培养7天后能形成圆形、梭形的细胞表型,10-14d细胞可铺满整个瓶底,光镜下可见铺路石样改变。采用流式细胞仪测到培养的细胞CD133、CD34的双标记阳性率为99.0%,激光扫描共聚焦显微镜双荧光染色试验显示培养的细胞稳定表达特异性抗原CD133、CD34。证明EPCs培养成功。应用已标记绿色荧光蛋白的EPCs移植脓毒症大鼠后,荧光成像显示1d后EPCs主要集中在胸腹部,并持续到第7d。冰冻组织切片荧光显微镜检测肺、肝及肾组织血管附近荧光分别较强,d7的组织标本荧光比dl均明显增强。EPCs移植可显著减轻脓毒症大鼠肺、肝及肾组织炎症细胞的浸润、细胞损伤,降低组织的W/D比值；降低炎症因子IL-6、IL-10表达,恢复促炎症反应及抑炎反应平衡；同时下调肺、肝及肾组织TLR4mRNA的表达。结论：1、采用密度梯度离心法,经体外培养、鉴定,成功分离出大鼠的骨髓EPCs;2、EPC静脉移植后能成功到达损伤大鼠的肺、肝及肾组织。3.LPS诱导的脓毒症大鼠模型中EPCs移植可显著缓解肺、肝及肾组织损伤,修复了损伤的血管从而通过减少炎性细胞渗出和粘附,减轻了炎症应答；通过调节免疫细胞,下调了促炎症反应的应答,使机体恢复促炎—抗炎平衡。4.实验结果表明EPC移植能改善LPS诱导的大鼠脏器损伤,为脓毒症治疗提供了新的思路。
【作者】徐喜媛；
【导师】王凌峰；杨敬平；
【作者基本信息】内蒙古大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】内皮祖细胞；干细胞移植；脓毒症；大鼠；

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