肾透明细胞癌分子靶向治疗中Sunitinib诱导细胞衰老和Klotho抑制上皮—间质转化的分子机制研究

【摘要】肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)简称肾癌,是起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤,约占成人肾恶性肿瘤的90%。组织学上,肾癌表现为一系列具有独特的形态和遗传特征的亚型。肾透明细胞癌(clear-cellrenalcellcarcinoma,CCRCC)是其中最常见的类型,起源于近曲小管上皮,占肾癌的70-80%。肾透明细胞癌的发生发展与VHL(vonHippel-Lindau)抑癌基因缺陷相关。pVHL突变导致缺氧诱导因子-α(hypoxia-induciblefactor,HIF-α)稳定性增加。HIF-α进入核内与HIF-β形成复合物转录激活一系列缺氧相关基因,进而促进肿瘤血管生成(VEGF,EPO),肿瘤细胞生长(TGF-α,PDGF-β,CyclinD)和糖代谢(GLUT1)。从而,为针对VHL通路的靶向治疗提供了强有力的理论依据。舒尼替尼(Sunitinib,SU011248)是靶向VHL通路的一种小分子多靶点受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinases,RTKs)抑制剂。已有研究表明舒尼替尼的主要作用靶点是表达在肿瘤血管内皮细胞及周细胞的血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)等,在抑制肿瘤血管形成过程中起重要作用。随着舒尼替尼广泛用于晚期肾癌的治疗,其发挥治疗效用及最终发生耐药的功能意义、分子机制亟待阐明,以克服耐药、巩固疗效,更好进行个体化靶向治疗。本研究第一部分围绕舒尼替尼治疗作用及其潜在机制展开。虽然VHL通路的分子靶向治疗取得了长足的进步,一定程度上延长了患者的生存时间,但总有效率仅为20-30%,并且存在治疗期间病情继续进展,不良反应明显等缺陷。因此,更深入地对肾癌病理学及分子生物学进行研究,有助于改进现有治疗手段并探索新的、行之有效的治疗靶点。Klotho作为特异性表达在肾小管上皮的抗衰老蛋白,主要参与调节钙磷代谢和能量代谢。尽管近年来Klotho作为肿瘤抑制基因的作用引起诸多关注,但对于Klotho在肾癌发生中的作用及其机制目前尚不明确。本研究主要围绕Klotho在肾癌中的作用及潜在的分子机制展开。在本研究的第一部分,多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼已被用作转移性肾细胞癌(metastaticrenalcellcarcinoma,mRCC)治疗的一线药物,但其发挥治疗效用的具体分子机制和功能效应仍不清楚。我们目前的研究发现舒尼替尼处理后的肾癌细胞表现出明显的衰老特征,包括衰老相关的p半乳糖苷酶(SA-(3-gal)活性增强,衰老的分子标志DcR2、Dec1表达增加,以及出现衰老相关的分泌表型(SASP),如促炎症细胞因子白介素-1α(IL-1Ｐ),白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的分泌增加。同时舒尼替尼可以抑制肾癌细胞的增殖,G1-S期的细胞周期阻滞和DNA损伤反应,进一步证明舒尼替尼诱导肾癌细胞衰老的治疗意义。机制研究表明舒尼替尼产生的治疗诱导衰老(therapy-inducedsenescence,TIS)效应主要归因于其对Raf-1/NF-κB抑制所导致p53/Dec1信号通路活化。进一步应用裸鼠皮下移植瘤实验证实了舒尼替尼治疗后可以显著抑制肿瘤生长及延长总生存期,并伴随着肿瘤组织p53、Dec1蛋白水平和SA-β-gal活性上调,Raf-1、Ki67蛋白水平下调。最后在接受舒尼替尼新辅助治疗肾癌患者肿瘤组织样本中验证了类似的现象。结论：这部分研究阐述了舒尼替尼发挥治疗效用可能是由于通过抑制Raf-1/NF-κB活性导致p53/Decl信号通路活化,最终产生治疗诱导衰老效应。在本研究的第二部分,Klotho是特异性表达于肾小管上皮细胞的抗衰老蛋白。已有研究表明Klotho在多种肿瘤中都发挥肿瘤抑制基因的作用,但在肾癌中潜在作用和分子机制还有待阐明。瘤内Klotho高表达与肿瘤大小,TNM分期和核分级呈负相关,Klotho高表达还预示着肾癌病人较好的预后。高表达Klotho的RCC患者的总生存率显著高于低表达的患者。在肾癌细胞中过表达Klotho可使肿瘤细胞形态从间质型转化为上皮型、上皮细胞标志分子(如E-cadherin)上调、间质细胞标志分子(如N-cadherin、vimentin)下调,提示Klotho表达可诱导肾癌细胞发生间质一上皮转化(mesenchymal-epithelialtransition,MET)。进一步研究发现表达Klotho介导的这种功能并不依赖于其特有的a-2,6唾液酸酶活性。此外,过Klotho表达通过抑制PI3K/Akt/GSK3β信号通路下调Snail蛋白水平,反之敲除Klotho可以上调Snail蛋白水平。PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂LY294002,GSK3β的特异性抑制剂LiCl可以分别重现过表达和敲除Klotho对Snail蛋白水平的影响。最后通过体外细胞划痕试验,Transwell细胞迁移实验和Collager细胞侵袭实验分析发现,在体外细胞培养中过表达Klotho抑制肾癌细胞的细胞迁移(cellmigration)和细胞侵袭(cellinvasion),组成性活化的Snail可逆转Klotho弱化的细胞迁移和侵袭能力,提示Klotho表达可能通过抑制肾癌细胞发生EMT从而参与到肾癌的侵袭和转移过程。结论：这部分研究阐明了Klotho在肾癌中的新功能,即抑制PI3K/AKT/GSK3β信号通路下调细胞中Snail蛋白水平从而抑制EMT发生、减弱细胞迁移和侵袭能力,该发现提供了靶向肾癌侵袭和转移的新机制。
【作者】朱煜；
【导师】林宗明；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】肾细胞癌；P53；Decl；细胞衰老；Klotho；Akt；Snail；上皮-间质转化；

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