甘蓝型油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP9和PGIP15基因克隆及真核表达

【摘要】黑胫病病原菌感染油菜时,病原菌会分泌一系列的聚半乳糖醛酸酶(PGs)来降解植物的天然屏障——细胞壁,并诱导油菜产生一系列抗性基因来防御黑胫病病原菌。其中特异性蛋白聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)能非竞争性的抑制病原菌的内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PGs)的活性,来抵御病原真菌的侵染,抑制病害的发生,从而增强植物的抗病性。所以PGIP是一个有效的抗真菌病害的蛋白,值得用于植物的抗病育种。但植物中直接分离纯化该蛋白有产率低、工艺复杂等弊端,因此希望通过本研究克隆出Pgip基因,构建出能够产生PGIP蛋白的工程菌株。本文克隆2个甘蓝型油菜的聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)相关基因,转入毕赤酵母中诱导表达,并检测黑胫病病原菌诱导甘蓝型油菜产生的PGIP蛋白对病原菌分泌的PG是否有抑制作用,为提高油菜黑胫病的抗性具有重大意义。主要研究内容如下：1、接种黑胫病病原菌NM—1孢子悬浮液于甘蓝型油菜——青杂5号子叶叶片,提取病斑周围叶片总RNA,扩增获得pgip9和pgip15的CDS编码序列,构建克隆载体pMD-19-T-pgip9/15。2、构建真核表达载体pPICZaA-pgip9/15,转入PichiapastorisPAMD16宿主细胞中构建工程菌株。SDS-PAGE及Westernblot检测,在36-37KDa处出现单一的融合蛋白条带。3、工程菌株诱导表达后,上清液中PGIP9和PGIP15蛋白含量分别为12.356μg/μL和11.976μg/μL。通过DNS法和琼脂糖扩散法检测确定表达蛋白PGIP9和PGIP15对黑胫病病原菌NM-1分泌的PG有一定的抑制作用。
【作者】燕孟娇；
【导师】苑琳；李子钦；
【作者基本信息】内蒙古大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】甘蓝型油菜；黑胫病；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白；结构预测；真核表达；

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