Transgelin2和miR-200a在乳腺癌转移中的分子机制研究

【摘要】目的：探索Transgelin2的功能以及其参与乳腺癌转移的相关机制方法：体外过表达和下调Transgelin2的表达,通过裸鼠移植瘤,Transwell实验研究transgelin2对乳腺癌细胞转移能力的影响。通过免疫共沉淀,质谱鉴定Transgelin2相互作用蛋白。通过流式细胞,细胞免疫荧光,免疫印迹,以及实时定量PCR,确定transgelin2参与的转移相关通路。通过临床病例验证Transgelin2表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移的相关性。结果：成功上调MDA-MB-231HM细胞Transgelin2的表达,移植瘤实验发现Transgelin2高表达组,成瘤率明显减低,成瘤体积明显减少(P=0.01)。使用pLKO.lshRNA成功下调MDA-MB-231细胞中Transgelin2的表达,下调Transgelin2后,Transwell实验显示,MDA-MB-231细胞侵袭能力增强(P<0.05)。表明Transgelin2为转移抑制基因。通过免疫共沉淀,质谱,成功鉴定到Transgelin2相互作用蛋白氧化还原酶1(PRDX1)。对微丝,线粒体和细胞核染色,发现下调Transgelin2后,细胞内的线粒体重新分布。DCFDA处理细胞后,测定细胞内的ROS发现,下调Transgelin2后细胞内的ROS增多。westernblot测定,细胞浆内的IKB减少,入核的p50,p65增多,NFKB通路激活。使用具有NFKB转录因子结合位点的荧光报告质粒,测定荧光素酶活性,结果显示下调Transgelin2后,荧光素酶活性为对照组的2.2倍,进一步验证Transgelin2下调后NFKB通路激活。下调Transgelin2后,RealtimePCR检测NFKB下游的调控基因,CXCR4,MMP1,MMP2在MDA-MB-231以及MCF-7中均表达增加。比较淋巴结转移阴性和阳性患者中,Transgelin2的表达,Transgelin2在淋巴结阳性患者中低表达,提示transgelin2移植乳腺癌的淋巴结转移。将下调transgelin2的MDA-MB-231经尾静脉注射裸鼠,下调Transgelin2组肺转移灶明显增多(P<0.05)。结论：Transgelin2为转移抑制基因,其可以与PRDX1相互作用,下调其表达后,细胞内线粒体重分布,ROS增多,NFKB通路激活,NFKB下游的CXCR4,MMP1,MMP2表达增加。临床病例以及动物实验均验证这一结果。目的：探索,miR-200a参与乳腺癌DNA损伤耐受以及转移的相关机制方法：建立吉西他滨耐药肿瘤细胞株以及放疗耐受肿瘤细胞株,检测其miR-200家族表达。比较新辅助化疗未达到完全缓解的病例与未行化疗病例中miR-200a的表达水平。生物信息学方法预测miR-200a靶点,3’UTR双荧光素酶报告实验验证结合位点。克隆形成实验,裸鼠移植实验,鉴定miR-200a的靶点,以及其功能。结果：成功建立吉西他滨耐药肿瘤细胞株以及放疗耐受肿瘤细胞株,RealtimePCR发现miR-200家族中,仅miR-200a在耐药和耐放疗的细胞中表达增加。miR-200家族中其他成员未观察到一致改变。miR-200ainhibitor部分逆转了细胞耐药和放疗耐受,提示niR-200a参与DNA损伤耐受。新辅助化疗未达到完全缓解的病例(耐药或化疗不敏感模型)中miR-200a表达为未行化疗病例组的3.3倍(P=0.037)。根据生物信息学预测,以及荧光报告实验,证实YAP1和TP53INP1为miR-200a新的靶点。WesternBlot发现miR-200a靶向YAP1间接下调p73,减少其下游调亡相关蛋白的表达。miR-200a能够间接抑制p73介导的调亡,乳腺癌细胞稳定表达miR-200a经悬浮培养72小时,与对照组相比调亡减少(具统计学差异),提示miR-200a抑制失巢调亡。克隆形成实验验证了这一结果,稳定表达niR-200a的MDA-MB-231经小鼠尾静脉注射,肺转移灶明显增多。miR-200a促进DNA损伤耐受,抑制失巢调亡,提示其表达与乳腺癌患者预后负相关。110例乳腺癌患者生存分析,发现miR-200a的表达水平,与乳腺癌患者的无病生存负相关(P=0.04I)。结论：miR-200a通过与YAP1,TP53INP1的3’UTR结合,下调其表达,间接抑制p73介导的调亡,促进DNA损伤耐受以及失巢调亡逃避,促进乳腺癌复发与转移。临床病例以及动物实验均验证这一结果。
【作者】喻三见；
【导师】邵志敏；
【作者基本信息】复旦大学，肿瘤学，2012，博士
【关键词】乳腺癌；转移；NF-κappaB；microRNA；耐药；

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