特异沉默Cx43对脑血管痉挛的影响

【摘要】自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage,SAH)是常见而又严重的脑血管意外之一,据WHO统计,其年发病率由我国的2/10万至芬兰的22.5/10万不等,其中近50%的SAH患者死于延迟性脑血管痉挛(cerebralvasospasm,CVS)。因此,脑血管痉挛是SAH后引起死亡或重残的最主要原因。尽管近几十年来CVS一直是国内外学者们研究的热点之一,但其机制至今未明,治疗亦无特效方法。缝隙连接(Gapjunction,GJ)是相邻细胞间离子及小分子物质交换的直接通道,是细胞间信息传递的重要途径。GJ由相邻的两个细胞各提供一个连接子(connexon)两两对接而形成,连接子由6个亚单位的连接蛋白(connexin,Cx)在细胞膜上寡聚形成。目前已发现20种不同的连接蛋白。在血管壁上Cx主要由Cx43、Cx40组成,此外还有Cx37和Cx45。GJ中心形成的孔道直径约为2nm,能够允许细胞间电流、离子、分子量小于1.2KDa、直径小于10nm的分子及第二信使(如Ca2+、cAMP、cGMP、IP3等)自由通过,成为电耦联、化学耦联和代谢耦联通道。相邻细胞间的物质传输称之为缝隙连接细胞间通讯,其参与了多种生物活动,如心肌和平滑肌细胞的协同有序收缩、细胞生长调控、肿瘤发生、信号转导、胚胎发育等。前期研究发现缝隙连接蛋白Cx43的高表达可能在脑血管痉挛中发挥重要作用。本实验在前期研究基础上拟采用RNA干扰的方法,进一步在体内、外研究缝隙连接蛋白Cx43在脑血管痉挛中的作用。首先在基底动脉平滑肌细胞中筛选出沉默效应最佳的siRNA；再通过体外筛选的最佳siRNA重组构建腺病毒载体,并且在体内实验中脑池内注入携带shRNA的重组腺病毒载体,继而检测Cx43的表达以判断沉默效率,最后通过在体内模型中特异性沉默Cx43并观察对脑血管痉挛的影响,进一步探究Cx43及缝隙连接在脑血管痉挛发生发展中的作用。方法：一、体外实验：(1)兔基底动脉平滑肌细胞的原代培养与鉴定：开颅取兔脑基底动脉,去除结缔组织和内膜,中膜应用组织贴块法培养平滑肌细胞,用光学相差显微镜和免疫细胞化学染色鉴定；(2)提取总RNA采用半定量RT-PCR检测正常组兔基底动脉平滑肌细胞的缝隙连接蛋白mRNA平均相对含量作为正常对照,扩增时β-actin引物提供内参对比,产物凝胶电泳,对电泳结果进行图像分析,把目的产物和β-actin产物条带灰度值之比作为该蛋白mRNA在其中的相对含量,收集结果,均数±标准差,采用t检验,进行统计分析；(3)设计并化学合成针对兔Cx43基因的特异性siRNA：依据ElbashirSMO、TuschlTRNAi的siRNA序列挑选原则,设计且化学合成针对兔缝隙连接蛋白Cx43基因的3对特异性siRNA和1对非特异性siRNA；(4)脂质体转染平滑肌细胞并筛选siRNA：脂质体siPORTNeoFX转染不同siRNA,应用半定量RT-PCR检测转染24h、48h、72h后不同浓度siRNA对细胞Cx43mRNA表达的影响,筛选抑制效应最好的siRNA及作用浓度；(5)脂质体转染siRNA对平滑肌细胞GJIC功能的影响：脂质体siPORTNeoFX转染筛选的siRNA及其浓度,染料传输实验检测siRNA对细胞间缝隙连接介导的通讯功能的影响。二、体内实验：(1)构建RNA干扰腺病毒载体：将前期研究证实的兔Cx43基因特异性378siRNA片段插入空的表达载体并据此构建穿梭质粒。采用腺病毒包装系统通过共转染293细胞构建重组腺病毒载体Ad5-H1-connexin43-shRNA-GFP;(2)观察腺病毒载体转染效率：单纯病毒组经脑池穿刺法将病毒注入正常兔的枕大池内,1d、3d、5d、7d及14d后处死动物,取基底动脉行荧光显微镜及光镜检测,RT-PCR、Westernblotting分别测定Cx43mRNA、蛋白表达水平；同时另设单纯溶媒组及单纯空病毒组,分别以保存病毒的溶媒及空病毒作为阴性对照；(3)建立兔二次蛛网膜下腔出血模型(脑血管痉挛模型)：按照不同时相分组,在建立模型前及建立模型后的1d、3d、7d、14d行DSA造影,比较各时相基底动脉直径的变化,光镜下观察血管壁组织形态学的变化；(4)检测建立模型后Cx43mRNA及蛋白表达的变化：在建立模型1d、3d、7d、14d后,RT-PCR、Westernblotting分别测定Cx43mRNA、蛋白表达水平,并分析Cx43不同时相表达的变化与建立模型后不同时相基底动脉直径的变化是否有相关性；(5)预处理组实验：设病毒预处理组、溶媒预处理组及空病毒预处理组3组,在建立二次蛛网膜下腔出血模型前5d经脑池分别给药行预处理。在建立模型前及建立模型后7d分别行DSA造影,比较前后两次造影基底动脉直径的变化,RT-PCR测定Cx43mRNA表达水平,Westernblotting测定Cx43蛋白表达水平,光镜下观察血管壁组织形态学的变化；(6)处理组实验：设病毒处理组、溶媒处理组及空病毒处理组3组均在建立二次蛛网膜下腔出血模型后30min经脑池途径分别行给药处理。在建立模型前及建立模型后7d分别行DSA造影,比较前后两次造影基底动脉直径的变化,RT-PCR测定Cx43mRNA表达水平,Westernblotting测定Cx43蛋白表达水平,光镜下观察血管壁组织形态学的变化。结果：一、体外实验：(1)细胞原代培养通过形态学观察和特异性抗α-actin抗体免疫组化染色鉴定它是平滑肌细胞并且高纯度；(2)设计3对特异性siRNA以及1对非特异性对照siRNA序列有：①378siRNA:CCTGAAGCAGATTGAGATA;②454siRNA:CTGCGAACCTACATCATCA;③654siRNA:GGTGTCTCTTGCCTTGGAAT;④非特异性siRNA:TTCTCCGAACGTGTCACGT;(3)转染siRNA对平滑肌细胞Cx43mRNA表达的调节：转染后细胞提取总RNA予半定量RT-PCR分析：和空白组比较,转染3对特异性siRNA组细胞Cx43mRNA灰度比显著降低,且50、100、15Onmol·L-1378siRNA对应的抑制效率是62.12±2.43%、73.23±3.11%以及82.31±5.14%(P均<0.01),体现为浓度依赖性。而50、100、150nmol-L-1454siRNA以及654siRNA的平均抑制率各是52.61±1.92%以及31.84±2.82%(p均<0.01)。转染非特异siRNA组细胞Cx43mRNA灰度比和空白对照相比都没有明显差异(p>0.05)。显然378siRNA的抑制率、稳定性最佳。随后转染150nmol·L-1378siRNA检测它的时间依赖性,结果表明转染8h,24h,48h,72h,96h后细胞Cx43mRNA表达的抑制率各是28.71±0.83%,38.7±0.81%,75.76±3.61%,85.93±0.87%,29.32±2.31%(p均<0.05),抑制率符合时间依赖性,1w左右RNA干扰效应仍可检测到；(4)378siRNA抑制平滑肌细胞缝隙连接介导细胞与细胞的信号传递：细胞转染378siRNA(150nmol·L-1)48h后,染料划痕实验表明和未处理组3-4层染色细胞比较,转染150nmol·L-1378siRNA细胞划痕双侧1-2层细胞染色,染料传输能力显著下降。二、体内实验：(1)构建RNA干扰腺病毒载体：鉴定毒种证实构建成功,行扩增、纯化生产,确认纯化程度在95%以上；(2)腺病毒载体转染效率：1)脑池内注入病毒后1d荧光显微镜下即在基底动脉外膜层见绿荧光蛋白表达,5d时达到高峰且平滑肌层有明显表达,7d时表达较强,14d时仍有表达；2)单纯病毒组Cx43mRNA表达及蛋白表达与正常兔相比明显降低,以5d、7d、14d尤为显著,单纯溶媒组、单纯空病毒组与正常兔相比均无明显差异；3)各组光镜下未见炎性反应：(3)建立兔二次蛛网膜下腔出血模型(脑血管痉挛模型)：DSA造影显示注血后1d即出现血管狭窄,7d时达高峰,14d时缓解。光镜下可见痉挛的血管内皮细胞核染色质聚集,内弹力膜呈显著波纹状,平滑肌细胞分布稀疏,周围红染组织明显增多,核长梭形,内弹力膜与平滑肌层间有水肿；(4)检测建立模型后Cx43mRNA及蛋白表达的变化：Cx43mRNA表达及蛋白表达在建立模型后1d、3d、7d、14d均升高,其中7d时为高峰。Cx43mRNA及蛋白表达的时相性变化同建立脑血管痉挛模型后基底动脉直径的时相性变化相比,相关系数分别为0.968、0.912,二者同基底动脉直径的时相性变化均存在直线关系。(5)预处理组实验：病毒预处理组前后两次DSA造影基底动脉狭窄与蛛网膜下腔出血组相比明显缓解(p<0.001),Cx43mRNA及蛋白的表达在1d、3d、7d、14d均显著低于蛛网膜下腔出血组,光镜下血管痉挛表现明显减轻；溶媒预处理组、空病毒预处理组上述指标与蛛网膜下腔出血组无明显差异；(6)处理组实验：病毒处理组前后两次DSA造影基底动脉狭窄与蛛网膜下腔出血组相比明显缓解(p<0.05),Cx43mRNA及蛋白的表达在1d、3d与蛛网膜下腔出血组无显著差异,但7d、14d显著低于蛛网膜下腔出血组,光镜下血管痉挛表现略有减轻；溶媒处理组、空病毒处理组上述指标与蛛网膜下腔出血组无明显差异。结论：缝隙连接参与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的病理过程,本课题通过RNA干扰技术特异抑制血管壁中Cx43表达后,蛛网膜下腔出血模型中脑血管痉挛程度得到显著缓解,提示脑血管平滑肌中的Cx43可能成为治疗脑血管痉挛的一个潜在靶点,仍需进一步深入研究其具体分子机制。
【作者】洪涛；
【导师】周良辅；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2012，博士
【关键词】脑血管痉挛；缝隙连接蛋白；基因干扰；

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