自噬对甲状腺滤泡癌放化疗增敏作用的研究

【摘要】自噬，是细胞分解胞内废用的细胞器及蛋白进行重新再利用的过程，细胞通过这种作用维持细胞内的稳态，实现自我平衡。研究表明，自噬对多种实体肿瘤的发生、发展、侵袭及转移发挥重要的作用。当细胞在面对乏氧、饥饿、病原体感染、电离辐射（IonizingRadiation，IR）及药物作用等应激条件下，就会诱导自噬发生，通过分解细胞内废用细胞器及长寿蛋白后重新利用，从而维持细胞的正常功能。在实体肿瘤的研究中发现，肿瘤的早期形成阶段，自噬通过分解再利用过程为肿瘤生长提供营养物质，对肿瘤的形成与发展发挥促进作用，而当肿瘤细胞面对电离放射或化学药物杀伤时，肿瘤细胞无法继续维持生存，此时肿瘤细胞也将诱导自噬产生，但在这种条件下，自噬发挥诱导细胞主动死亡的作用。已有研究结果表明，电离辐射及化疗能够诱导肿瘤细胞产生自噬，自噬相关PI3K-AKT-mTOR信号通路的异常表达在甲状腺滤泡癌的发生、发展、侵袭及转移方面具有重要作用，该通路的异常降低在一定程度上降低了电离辐射及化疗药物对甲状腺滤泡癌的治疗效果。研究发现，甲状腺滤泡癌中存在着PI3KCA增殖增加。随着对甲状腺滤泡癌相关基因及PI3K信号通路异常改变的深入研究，针对该通路抑制剂的靶向治疗也将成为低分化型甲状腺癌、甲状腺癌恶性转移等的又一新兴治疗手段。目前，PI3K信号通路抑制剂联合放化疗治疗多种恶性肿瘤的研究已充分展开，并逐步进入临床试验阶段，但在甲状腺滤泡癌中的相关报道很少。因此本实验通过研究自噬对甲状腺滤泡癌放化疗增敏作用，为PI3K-AKT-mTOR信号通路调控剂联合放化疗治疗甲状腺滤泡癌的转化医学研究提供一定的理论基础，并为全面优化甲状腺滤泡癌的治疗策略提供依据。目的：探讨自噬对甲状腺滤泡癌放化疗增敏作用的影响，研究甲状腺滤泡癌放化疗联合自噬抑制剂对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：（1）构建甲状腺滤泡癌FTC-133细胞PI3KCA基因的沉默模型；（2）应用细胞增殖检测实验检测细胞增殖活性；（3）应用蛋白免疫印迹法检测蛋白水平变化；（4）应用MDC荧光法检测细胞自噬情况；（5）应用SPSS19.0软件进行数据分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。结果：（1）构建FTC-133PI3KCA沉默模型根据GenBank中PI3KCA的基因信息，调取人cDNA全长序列，使用Primer3软件进行引物设计并测序，将引物构建到带有嘌呤酶素抗性及荧光素酶的慢病毒载体，转染FTC细胞，同时建立转染干扰靶基因的空载体进行对照实验，最终建立稳定的基因沉默模型，并经荧光显微镜观察转染后细胞的荧光效应证实转染成功。（2）PI3KCA基因及LY294002在FTC133细胞中的作用机制为进一步研究PI3KCA基因及LY294002在FTC133细胞中的作用机制，采用WesternBlot法检测相关靶蛋白的表达情况。分别对FTC133细胞的PI3KNC组与PI3KCA沉默组的AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-P70蛋白表达进行检测，结果发现PI3KCA沉默组的上述蛋白表达均明显低于对照组。FTC133细胞的对照组与LY294002抑制组进行PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-P70蛋白表达检测，结果发现LY294002抑制剂组与对照组相比，PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-P70蛋白表达也均明显下降。（3）FTC133细胞的放化疗敏感性应用CCK8法对FTC133放化疗作用后的细胞增殖活性进行检测。分别对给予0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射的FTC133细胞进行细胞增殖活性的检测，结果发现4Gy照射组中细胞增殖活性受到抑制（P<0.05），具有杀伤肿瘤细胞的作用。分别对给予0nM、10nM、50nM、100nM、1000nM表阿霉素作用的FTC133细胞进行细胞增殖活性的检测，结果发现100nM组中细胞增殖活性受到抑制（P<0.05），具有对肿瘤细胞的杀伤作用。（4）FTC133细胞对LY294002的药物敏感性采用CCK8法检测不同浓度LY294002对FTC133细胞增殖活性的影响。使用DMSO溶解LY294002，并稀释成0uM、25uM、50uM、100uM、200uM工作液，分别加入FTC133细胞培养液中进行培养。分别将加入等体积DMSO培养的FTC133细胞作为对照组。培养后，使用CCK8法进行细胞增殖活性的检测。结果发现，LY100uM时具有明显的细胞增殖活性抑制作用，故将50uM作为LY294002在本研究中的作用浓度。（5）PI3KCA基因对FTC133细胞放化疗作用的影响应用CCK8法对细胞增殖活性进行检测。将FTC133细胞分为对照组、DMSO组、LY294002抑制剂组、PI3KNC组、PI3KCA沉默组，分别给予IR4Gy后进行检测。结果发现，4Gy照射后16小时出现LY294002抑制剂组较DMSO组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）；DMSO组与对照组之间细胞增殖活性无显著差异。4Gy照射后16小时出现PI3KCA沉默组较PI3KNC组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）；PI3KNC组与对照组之间细胞增殖活性无显著差异。应用CCK8法对细胞增殖活性进行检测。将FTC133细胞同上分为对照组、DMSO组、LY294002抑制剂组、PI3KNC组、PI3KCA沉默组，分别给予表阿霉素100nM后作用24小时进行检测。结果发现，100nM表阿霉素作用24小时出现LY294002抑制剂组较DMSO组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）；DMSO组与对照组之间细胞增殖活性无显著差异。100nM表阿霉素作用24小时出现PI3KCA沉默组较PI3KNC组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）；PI3KNC组与对照组之间细胞增殖活性无显著差异。（6）自噬对FTC133细胞放化疗增敏作用的影响采用MDC荧光法检测细胞自噬情况。本研究中，FTC133细胞自噬的本底阳性率为4%。首先对FTC133正常细胞组、DMSO组、LY294002抑制剂组、PI3KNC组、PI3KCA沉默组的本底自噬细胞阳性率进行分析，结果分别为4%、5%、9%、34%、52%。分别对FTC133正常细胞组、DMSO组、LY294002抑制剂组、PI3KNC组、PI3KCA沉默组进行4Gy照射，培养16小时后，采取同样方法计算自噬细胞阳性率，结果为35%、28%、78%、46%、89%。对FTC133正常细胞组、DMSO组、LY294002抑制剂组、PI3KNC组、PI3KCA沉默组进行100nM表阿霉素处理，培养24小时后，采取同样方法计算自噬细胞阳性率，结果为39%、32%、93%、52%、97%。结论：1、甲状腺滤泡癌细胞放化疗研究中，最小有作用杀伤剂量分别为放射剂量4Gy，表阿霉素浓度100nM。2、在甲状腺滤泡癌细胞中，PI3KCA沉默模型及应用PI3K抑制剂LY294002，均能够发挥抑制自噬相关PI3K-AKT-mTOR信号通路的作用。3、CCK8实验证实，PI3KCA沉默模型及应用PI3K抑制剂LY294002，增加甲状腺滤泡癌的放化疗敏感性。4、MDC实验证实，PI3KCA介导的甲状腺滤泡癌的放化疗增敏作用是通过自噬途径完成的。
【作者】连丽新；
【导师】孙辉；
【作者基本信息】吉林大学，临床医学，2014，硕士
【关键词】自噬；PI3K-AKT-mTOR信号通路；甲状腺滤泡癌；放化疗敏感性；

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