选择性Cox-2抑制剂Celecoxib通过Cox-2非依赖性途径促进肺癌细胞发生上皮—间质转化（EMT）

【摘要】非小细胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma,NSCLC)约占肺癌的80%-85%,其恶性程度高、预后差,死亡率高居恶性肿瘤之首,是严重影响人类健康的重大疾病。肿瘤转移是导致非小细胞肺癌临床治疗失败的重要原因,抑制转移是延长非小细胞肺癌患者生存时间的关键,也是非小细胞肺癌研究的前沿热点。上皮间质转化(epithelialmesenchymaltransitions,EMT)是指肿瘤细胞在各种炎症因子、细胞因子的刺激下失去极性与细胞间连接,同时获得间质细胞表型,运动和迁移能力增强的现象,是肿瘤转移过程中的关键事件。已有研究显示环氧合酶2(Cox-2)可能参与了转化生长因子β1(TGF-β1)等诱导的EMT过程；而Cox-2的表达水平与非小细胞肺癌患者的预后呈负相关,提示Cox-2抑制剂可能为非小细胞肺癌抗转移治疗提供了契机。基于上述认识,已有相当多的临床研究中将选择性Cox-2抑制剂如Celecoxib等作为辅助用药用于非小细胞肺癌的临床治疗。然而,值得关注的是,Celecoxib与表皮细胞生长因子受体抑制剂合用并未使非小细胞肺癌患者取得临床获益,提示有必要对Cox-2抑制剂在EMT及肿瘤转移中的作用进行更深入系统地研究,为非小细胞肺癌的辅助治疗提供实验依据。针对上述关键科学问题,本研究以广泛使用的Cox-2选择性抑制剂Celecoxib和Etodolac为研究对象,探讨二者对TGF-β1诱导的非小细胞肺癌EMT过程的影响及其分子机制。研究发现Celecoxib能时间及浓度依赖地促进A549非小细胞肺癌细胞发生EMT,表现为EMT的分子标志E-cadherin、Vimentin的表达水平变化；细胞形态的改变；以及细胞运动迁移能力的增强。我们在Cox-2不表达的MCF-7细胞上观察到相似的效应,提示Celecoxib促进EMT的效应不依赖于其对Cox-2的抑制作用。另外,与已有报道一致,Etodolac能够抑制EMT的发生,提示Cox-2抑制剂对EMT的影响有一定的复杂性,可能与药物的结构密切相关。进一步的分子机制研究发现Celecoxib促进EMT发生的作用与经典的TGF-β1/Smad信号通路无关。Celecoxib同时激活MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路,而其促进EMT的作用主要通过MEK/ERK信号通路实现。综上所述,本研究发现Cox-2抑制剂Celecoxib能激活MER/ERK信号通路,促进非小细胞肺癌细胞EMT发生,且该作用不依赖于其对Cox-2的抑制作用。不同结构的Cox-2抑制剂其作用具有很大的差异性。上述发现为重新审视Cox-2抑制剂辅助非小细胞肺癌化疗的临床治疗策略提供了重要的理论依据,提示Cox-2抑制剂辅助治疗恶性肿瘤的临床研究有增加患者转移的风险,需要非常慎重。第一部分Celecoxib促进A549细胞发生EMT目的以TGF-β1诱导NSCLC细胞系A549细胞,建立EMT体外研究模型。并给予不同剂量的Celecoxib,初步探讨Celecoxib对A549细胞EMT过程的影响。方法1、以1ng/ml的TGF-β1在无血清的培养条件下刺激A549细胞72h,并根据Celecoxib的血药浓度峰值选择不同剂量的Celecoxib(2,4,6uM),与1ng/ml的TGF-β1合用或者单独作用于A549细胞,通过westernblot的方法检测E-cad、vimentin的表达情况,研究Celecoxib对EMT效应的影响是否具有浓度梯度。根据上述实验结果选择最佳的Celecoxib剂量,与1ng/ml的TGF-β1合用或者单独作用于A549细胞24-72h,通过westernblot的方法检测E-cad、vimentin的表达情况,研究Celecoxib对EMT的影响是否具有时间梯度。2、上述方法的结果选择Celecoxib的最佳使用剂量与应用时间,通过免疫荧光的方法检测A549细胞表面E-cad、vimentin的表达情况。3、以Celecoxib的最佳使用剂量作用于A549细胞,通过transwe11迁移实验研究Celecoxib能否影响A549细胞的迁移能力。结果1、1ng/ml的TGF-β1作用于A549细胞72小时,E-cad表达下降,vimentin表达增加,细胞由上皮样向梭形的间质细胞样转变。2-6μM的Celecoxib与TGF-β1合用后,TGF-β1所致的E-cad下降及vimentin增加被加剧；同时,Celecoxib本身就可以导致A549细胞E-cad表达下降,vimentin表达增加。且随着剂量增加或者作用时间延长,Celecoxib导致的EMT相关标志物变化更加明显。然而,单独应用Celecoxib,A549细胞不会出现明显的形态变化。2、免疫荧光结果显示Celecoxib导致的A549细胞E-cad下降及vimentin表达增加,随着用药剂量的加大而加强。3、4μM或者6μM的Celecoxib作用于A549细胞18h后,细胞迁移能力明显增强。结论实验研究证实Celecoxib通过非TGF-β1依赖性途径促进A549细胞发生EMT,增强A549细胞的迁移能力。第二部分Celecoxib诱发的EMT不依赖于其对Cox-2的抑制作用目的探讨Celecoxib诱发的EMT效应是否与Cox-2蛋白有关。第一、以不表达Cox-2蛋白的MCF-7细胞作为研究对象,以不同剂量的Celecoxib刺激MCF-7细胞,观察MCF-7细胞EMT相关表型变化。第二、研究另一种选择性Cox-2蛋白抑制剂依托度酸(Etodolac)对A549细胞EMT相关表型的影响。方法1、通过westernblot检测A549细胞与MCF-7细胞Cox-2蛋白的表达情况。2、以无血清的DMEM培养MCF-7细胞,将不同剂量的Celecoxib(2,4,6uM)作用于MCF-7细胞24-48h,通过westernblot的方法检测E-cad、vimentin的表达情况。3、以1ng/ml的TGF-β1在无血清的培养条件下刺激A549细胞72h,并加入不同剂量的Etodolac(5,10μM),通过westernblot的方法检测E-cad、vimentin的表达情况。单独应用5-10μM的Etodolac刺激A549细胞,72h后通过westernblot的方法检测E-cad、vimentin的表达情况。结果1、A549细胞表达Cox-2蛋白,但MCF-7细胞不表达Cox-2蛋白。2、2-6μM的Celecoxib作用于MCF-7细胞48小时后,MCF-7细胞的E-cad表达下降,vimentin表达增加。6μM的Celecoxib刺激MCF-7细胞24h即可以出现E-cad下降及vimentin增加,48h后该效应更显著。3、TGF-β1导致的A549细胞E-cad下降及vimentin表达增加被Etodolac逆转了。Etodolac单独应用就可以促进A549细胞表达E-cad,抑制A549细胞vimentin的表达。结论Celecoxib通过Cox-2蛋白非依赖性途径促进EMT。不同的Cox-2抑制剂对EMT过程的影响不一样,Celecoxib促进A549细胞发生EMT,但Etodolac抑制A549细胞的EMT过程。第三部分Celecoxib通过激活MEK/ERK通路促进EMT。目的探讨Celecoxib诱发A549细胞发生EMT的主要机制。方法1、A549细胞与MCF-7细胞以无血清的DMEM饥饿24h后,加入不同浓度的Celecoxib(2,4,6μM)？刺激5-180min,通过westernblot的方法检测磷酸化MEK、AKT、ERK、Smad2、Smad3(p-AKT、p-ERK、p-Smad2、p-Smad3)及其本底蛋白表达量。2、A549细胞在无血清的培养条件下,给予6uMCelecoxib与1uMMEK抑制剂(AZD6244)、PI3K抑制剂(Wortmannin)、AKT、p-ERK、E-cad、vimentin抑制剂(MK-2206),通过westernblot的方法检测p-MEK、p-AKT、的表达。结果1、无论A549还是MCF-7细胞,Celecoxib均促进MEK、AKT、ERK的磷酸化,p-MEK、p-AKT、p-ERK在Celecoxib刺激5-15min左右达到高峰,可以持续2-3小时,但Smad2、Sraad3蛋白磷酸化不受Celecoxib影响。2、在A549细胞,AZD6244抑制了p-ERK的表达,但是p-AKT的表达增加了,同时逆转了Celecoxib所致的E-cad下调。Wortmannin与MK-2206均抑制AKT磷酸化,而ERK的磷酸化却被增强了；同时,MK-2206加剧了Celecoxib所致的E-cad表达下降。3、AZD6244逆转Celecoxib导致的A549细胞E-cad下降,但却加剧了Celecoxib导致的Cox-2蛋白下降。由此可见,Cox-2表达与E-cad不相关。结论MEK/ERK与PI3K/AKT通路同时被Celecoxib活化并互相拮抗,Celecoxib促进EMT的效应主要是MEK/ERK活化的结果；此外,Cox-2表达与E-cad不相关。
【作者】王自力；
【导师】瞿介明；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2012，博士
【关键词】TGF-β1；Celecoxib；E-钙粘素；波形蛋白；环氧合酶-2；MEK/ERK；PI3K/AKT；Smads；

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