层层自组装肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体促进小口径ePTFE人工血管内皮化的实验研究

【摘要】第一部分层层自组装肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体小口径ePTFE人工血管的制备目的研究层层自组装肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体小口径ePTFE人工血管的制备过程及表面修饰涂层的稳定性,探讨制备优良涂层效果的可行性。方法采用层层静电组装的方法将带负电荷的肝素与带正电荷的胶原交替涂覆到小口径ePTFE人工血管上,随后在其表面接枝CD133抗体,制备成功能性人工血管。采用扫描电镜,红外光谱仪评价制备过程中涂层的变化,激光共聚焦显微镜观察CD133抗体在涂层表面的接枝情况,接触角测试仪检测ePTFE血管材料表面修饰后亲水性的改变。使用脱色摇床将肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体的ePTFE人工血管材料置入PBS溶液中洗涤2h,6h,12h,24h,48h,采用激光共聚焦显微镜观察各个时间点ePTFE人工血管材料表面CD133抗体荧光强度变化。结果扫描电镜观察结果示经过肝素/胶原溶液反复处理后的ePTFE血管材料表面可见一层膜状物,即肝素/胶原复合电解质膜；红外光谱仪探测曲线的改变及肝素胶原特征性波峰的出现提示经过肝素/胶原溶液反复交替处理后,涂层的厚度在增加；激光共聚焦显微镜观察结果显示ePTFE血管材料表面有较强的PE标记的红色荧光信号,证实了ePTFE复合涂层血管材料表面CD133抗体接枝成功。ePTFE血管材料经过表面涂层修饰后接触角测试结果显示由127.24度降至106.86度,提示涂层修饰后的血管亲水性增加。肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体的ePTFE人工血管材料经过PBS溶液洗涤2h,6h,12h,24h,48h,后,激光共聚焦显微镜仍然可以观察到较强的红色荧光信号,提示ePTFE人工血管材料表面涂层稳定,CD133抗体接枝效果良好。结论层层自组装肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体小口径ePTFE人工血管的制备过程是可行的,且功能性涂层效果良好。第二部分层层自组装肝素／胶原复合涂层接枝CD133抗体小口径ePTFE人工血管的体外实验研究目的研究层层自组装肝素／胶原复合涂层接枝CD133抗体小口径ePTFE人工血管材料的抗凝血性能,血液相容性及生物相容性。方法采用层层静电自组装的方法将带负电荷的肝素与带正电荷的胶原交替涂覆到小口径ePTFE人工血管材料上,随后在其表面接枝CD133抗体,制备成复合涂层人工血管。参照IS010993及GB/T16886标准中相关实验方法行血小板粘附实验,溶血实验,血浆复钙时间实验和APTT、PT、TT测试,评价复合涂层人工血管的血液相容性,同时对表面复合涂层修饰后的血管材料行大白鼠短期皮下植入实验,细胞粘附实验,CCK-8和LDH释放实验,评价复合涂层修饰人工血管的生物相容性。结果扫描电镜检测观察到底物ePTFE人工血管材料表面有大量血小板黏附,血小板呈扁平状贴覆在材料表面,肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体或未接枝抗体的ePTFE血管材料表面有少量血小板贴覆(p<0.05)；肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体或未接枝抗体的ePTFE血管材料及底物ePTFE血管材料的溶血率分别为1.56%,0.71%和2.41%,均小于5%,符合材料溶血性要求；底物ePTFE血管材料的血浆复钙时间为510±137.5s,肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体或未接枝抗体的ePTFE血管材料观察至30min未见纤维蛋白丝。肝素／胶原复合涂层接枝CD133抗体或未接枝抗体的ePTFE血管材料的APTT、PT、TT较底物ePTFE血管材料有了较大幅度提高。大白鼠短期皮下植入实验提示表面复合涂层修饰后的ePTFE人工血管材料周围组织炎症反应较未处理的ePTFE人工血管稍轻,但无明显差异。细胞粘附实验提示经肝素胶原复合涂层接枝CD133抗体或未接枝抗体的ePTFE人工血管材料表面细胞生长良好,不影响细胞的粘附性。CCK-8细胞毒性实验和LDH释放实验结果提示本实验中所使用的涂层制备材料肝素、胶原及CD133抗体对细胞的增殖活力无显著影响且无毒性,生物相容性良好。结论层层自组装肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体小口径ePTFE人工血管材料具有良好抗凝血性能,血液相容性及生物相容性。第三部分实验猪颈动脉及股动脉小口径人工血管移植模型的比较目的比较实验猪颈动脉及股动脉小口径人工血管移植模型的优缺点。方法12只健康实验猪,共进行颈动脉小口径人工血管移植12次,股动脉小口径人工血管移植4次。从颈动脉及股动脉血管的解剖,术中血管吻合操作的难易以及模型是否有利于评价术后移植血管通畅等发面比较颈动脉及股动脉人工血管移植模型的优缺点。结果从血管解剖角度讲,颈动脉位置较深,吻合操作较困难,但血管管径较粗,且分支少。股动脉较颈动脉位置表浅,更容易定位分离,术中操作易于暴露,吻合较为容易,但血管穿支血管较多,容易损伤出血。颈动脉和股动脉小口径人工血管移植模型中,当人工血管发生血栓形成时,实验猪术后均未能观察到异常临床表现,术后临床观察不能帮助准确判断移植血管通畅与否。结论实验猪颈动脉及股动脉人工血管移植模型的建立均具有可行性,但二者各有利弊,均可以作为研究小口径人工血管的动物模型。第四部分肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体促进6mm口径ePTFE人工血管内皮化的研究目的诸多研究表明早期快速内皮化可以一定程度上提高移植人工血管的通畅率。本节研究肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体是否可以促进6mm口径ePTFE人工血管快速内皮化。方法采用的动物模型包括猪颈动脉血管移植模型及股动脉血管移植模型两种。纳入本组研究的健康实验猪4只,共进行血管移植模型建立8次。植入的底物ePTFE血管2根,肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体的ePTFE人工血管3根,接枝CD34抗体的ePTFE人工血管3根。采用血管彩超或CTA检测移植血管的通惕情况及近心端和远心端吻合口形态,直径及流速。基于计算机的流体力学分析软件体外模拟移植血管的局部血流动力学情况,分析6mm口径ePTFE人工血管局部血流动力学特点。手术后饲养7天,对实验动物进行取材,进行大体标本观察,扫描电镜观察植入的人工血管表面形态,同期进行组织病理学分析及vWF免疫组化染色,观察移植血管表面有无内皮形成。结果移植的6mm口径ePTFE人工血管通畅率达100%。术后即刻血管彩超及CTA检查提示血管吻合口形态良好,无明显狭窄。基于计算机的流体力学分析结果提示6mm口径ePTFE人工血管对局部血流动力学影响较小,移植血管局部压力、切应力、血流流线良好。大体标本观察示肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体和接枝CD34抗体的ePTFE人工血管腔面较为光亮,裸ePTFE人工血管较为粗糙,少量附壁血栓形成。组织病理学分析示接枝CD133抗体和接枝CD34抗体的修饰的血管表面较裸血管表面有膜状物形成,vWF染色结果显示阳性明显。扫描电镜结果提示接枝CD133抗体的血管表面较多内皮细胞附着,接枝CD34抗体的血管次之,底物血管材料表面最少。结论肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体进行表面修饰ePTFE人工血管可以促进人工血管快速内皮化,其抗血栓形成能力尚需进一步评估。第五部分肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体4mm小口径ePTFE人工血管血栓形成的原因分析目的直径4mm的小口径ePTFE人工血管由于容易发生血栓形成而导致移植血管堵塞,迄今为止尚未得到有效解决。该部分拟对4mm小口径ePTFE人工血管发生血栓形成的原因作一分析。方法采用的动物模型包括实验猪颈动脉血管移植模型及股动脉血管移植模型。本组研究采用实验猪12只,共进行血管移植16次(颈动脉血管移植12次,股动脉血管移植4次),植入肝素/胶原复合涂层接枝CD133抗体ePTFE人工血管6根,肝素/胶原复合涂层ePTFE人工血管4根,底物ePTFE人工血管3根,肝素/胶原复合涂层接枝CD34抗体ePTFE人工血管3根。术后采用血管彩超对移植血管近心端及远心端吻合口形态,吻合口直径和吻合口流速进行检测,采用CTA对实验猪主动脉弓及弓上血管重建,观察植入血管的整体形态。采用CAST-I型体外血栓模拟仪和血液粘度计对实验猪的血液理化性质进行检测。基于计算机流体力学分析软件模拟移植血管的局部血流动力学情况,分析局部血流动力学改变在小口径ePTFE人工血管血栓形成中的意义。术后饲养7天,对实验猪进行取材,观察植入人工血管的大体形态,同时对人工血管进行组织病理学分析及vWF免疫组化染色,观察移植的人工血管表面有无内皮形成。结果移植的小口径ePTFE人工血管整体血栓堵塞率高达87.5%。CAST-I体外血栓模拟仪和血液粘度计检测结果提示纳入研究的实验猪不存在容易导致血栓形成的血液方面的异常因素。基于计算机流体力学分析结果提示ePTFE人工血管自身弹性较差,不能随血液压力变化发生容受性扩张,植入的人工血管形成较明显的缩窄管,可以导致近心端及远心端吻合口附近血液流体力学紊乱。大体标本观察示发生血栓形成的标本,吻合口近心端及远心端均有血栓形成,血管仍然通畅的标本表面亦有少量附壁血栓形成。组织病理学分析及vWF染色结果显示三组人工血管表面均有不同程度的内皮细胞覆盖,提示发生血栓形成前ePTFE人工血管已发生不同程度的内皮化,但形成的内皮细胞不足以对抗血栓形成。结论早期血栓形成是阻碍小口径ePTFE人工血管临床应用的重要因素,其发生原因复杂。移植血管局部血流动力学的紊乱是导致小口径人工血管血栓形成的重要原因。提高吻合口质量,加强抗凝以及促进快速内皮化有可能对抗移植管局部血流动力学的改变,从而提高其通畅率。
【作者】陆树洋；
【导师】王春生；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】聚四氟乙烯；小口径；人工血管；肝素/胶原复合涂层；CD133；血液相容性；生物相容性；颈动脉；股动脉；模型；动物；猪；CD133抗体；CD34抗体；内皮化；血流动力学异常；血栓形成；

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