瑞舒伐他汀促大鼠急性心梗后心肌组织修复的实验研究

【摘要】随着人们生活水平的提高以及城市化生活方式的普及,心肌梗死和心梗后心衰的发病率逐年递增,成为威胁公众健康和增加医疗支出的重要原因。目前,心梗后心衰已经成为发达地区人群最主要的致死和致残原因之一。出现心衰症状的病人5年死亡率高达50-70%。虽然干细胞治疗在心梗后心衰的临床前期研究中取得了一些令人鼓舞的结果,但其临床获益总体来说相对有限,且疗效缺乏持续性。因此找到促进缺血损伤心肌组织修复,增加干细胞疗效的干预手段成为这一研究领域亟需突破的瓶颈问题。近来有研究表明,心肌细胞的损伤和死亡能够启动自体修复机制,改变组织微环境,以促使成体干细胞迁移至损伤局部进行组织修复2。以往的研究发现,缺血损伤心肌能够表达多种细胞因子,如间质细胞源性因子-1(stromal-cellderivedfactor-1,SDF-1)、血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、细胞间粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)、缺氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF)、基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9),和血管细胞粘附分子-1(vascularcelladhesionmolecule-1,VCAM-1)等。这些细胞因子既可作为趋化分子,刺激干细胞归巢,促进其定向分化以及与目标组织的整合,同时也能作为炎症因子,加重局部心肌的炎症反应和细胞过度增殖。因此,缺血损伤心肌的局部微环境对于心梗后组织修复、疤痕形成和心脏重构是至关重要的,将对心梗后心功能的预后起决定性作用。本实验研究的目的,旨在探索对缺血损伤心肌局部微环境进行干预的具体手段和干预时机,以维持组织修复和疤痕形成、心室重构之间的平衡,创造组织修复最佳条件。他汀类药物作为抗动脉粥样硬化的一线药物已经广泛应用于心血管领域,其安全性和降脂作用以外的心血管保护作用已经被普遍认同。瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)是他汀家族的年轻成员,已被证明具有强效降低低密度脂蛋白水平的作用8。有报道认为,他汀类药物能够动员自体干细胞,增加循环中内皮祖细胞数量,促进内皮祖细胞血管新生2。然而,他汀类药物,尤其是瑞舒伐他汀,其促进缺血性心肌病组织修复的机制目前尚不明确。同时,他汀类药物对缺血心肌的局部微环境和个体内环境的调节作用尚无全面的研究结果。本研究首次在大鼠急性心梗模型中,研究口服瑞舒伐他汀治疗是否影响SDF-1/CXCR-4通路、HIF-1α、VEGF、ICAM-1等细胞因子在外周血以及心肌组织不同部位的表达水平；比较瑞舒伐他汀体内干预在心梗后不同的时间点对上述细胞因子表达水平的变化,并结合其与自体干细胞动员、心肌组织修复和心功能保护之间的关系,探索他汀类药物促进缺血心肌组织修复的可能机制以及最佳干预时间和条件。第一部分瑞舒伐他汀改善大鼠心梗后左室重构和收缩功能取6周龄雄性SD大鼠,随机分为两组。干预组给予瑞舒伐他汀(5mg/kgQD)灌胃给药,对照组予0.5%羧甲基纤维素钠(sodiumcarboxymethylcellulose,CMC-Na)溶液灌胃,两组灌胃液体积相同,每日灌胃一次,持续7天。第8天所有大鼠行开胸直视下永久结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。术后两组继续分别予瑞舒伐他汀(5mg/kgQD)和相同体积0.5%CMC-Na溶液每日灌胃,持续至术后28天或处死前1天。两组大鼠于术后10天、28天两个时间点行超声心动图检查。二维超声心动图与M-mode超声心动图检查发现,瑞舒伐他汀治疗组大鼠左室腔较对照组缩小,左室前壁运动改善。比较两组在不同时间点的左室射血分数和左室短轴缩短率发现,瑞舒伐他汀治疗能阻止大鼠心梗后左室功能的恶化,在心梗后28天较对照组明显改善左室收缩功能(P<0.01)。心梗后28天取材对大鼠心脏组织分别进行HE和Masson染色,显微镜下观察发现,瑞舒伐他汀治疗组与对照组相比,梗死区心肌厚度增加,梗死面积缩小,胶原纤维组织增生明显减少。实验结果证实,口服瑞舒伐他汀治疗能够显著改善大鼠心梗后心功能,这与其缩小梗死范围,减少胶原纤维增生,改善心室重构,抑制心梗后心腔扩大等作用机制有关。第二部分瑞舒伐他汀治疗对大鼠心梗后细胞因子表达的调节于建模后3天、7天、28天三个时间点分别采集大鼠静脉血,离心后取血清行ELISA,测定血清中SDF-1、HIF-1α、VEGF、ICAM-1和VCAM-1的水平。于建模后4天、7天、14天三个时间点处死动物,分别用实时荧光RT-PCR方法和Westernblot方法检测不同时间点左室前壁梗死周边(缺血区)以及左室后壁(非缺血区)心肌组织中SDF-1、CXCR-4、HIF-1α、VEGF、ICAM-1的mRNA转录和蛋白质表达水平。于术后28天处死动物,取左心室,于4%甲醛溶液中固定,常规脱水,石蜡包埋,切片。用免疫组织化学方法,观察两组大鼠梗死周边心肌中SDF-1、CXCR-4、HIF-1α、ICAM-1、和VEGF的表达情况。第二部分实验结果证实：大鼠急性心梗后,血清SDF-1和VCAM-1明显上升。瑞舒伐他汀治疗能在心梗后1周以内增强血清SDF-1的上调反应。大鼠急性心梗后,心肌组织中SDF-1、CXCR-4、HIF-1α、ICAM-1、和VEGF的表达水平在1周以内较高,后逐渐下降,缺血区较非缺血区细胞因子表达水平的上升幅度更大。瑞舒伐他汀治疗能进一步上调心肌组织SDF-1表达,使急性心梗后组织SDF-1高表达期延长,同时下调CXCR-4、HIF-1α、ICAM-1和VEGF表达,对大鼠心梗后心肌组织局部微环境进行调控和优化。瑞舒伐他汀对缺血微环境调控作用具有区域和时间选择性。通过对心梗后不同部位心肌组织间和心梗后各时间点间的结果比较,证实瑞舒伐他汀对心梗后心肌组织微环境的调控作用在缺血区心肌组织中更为显著,且作用时间窗位于急性心梗后1周左右,至心梗后2-4周时两组间各细胞因子表达无明显差异。第三部分瑞舒伐他汀增加大鼠心梗后心肌内干细胞数量并促血管新生心梗建模后28天处死动物,取左心室,于4%甲醛溶液中固定,常规脱水,石蜡包埋,切片。用免疫组织化学方法,观察两组大鼠心肌中CD90+(骨髓间充质干细胞表面标志19-20)、c-kit+(心脏干细胞表面标志21-22)和CD133+(内皮祖细胞表面标志23-26)的表达情况。实验结果发现,与对照组相比,心梗后28天时瑞舒伐他汀治疗组心梗周边心肌组织中CD90+和c-kit+细胞数显著增加(P<0.01),每高倍镜视野下CD133+毛细血管数较对照组显著增加(P<0.01)。实验结果证实,瑞舒伐他汀治疗能够增加大鼠心梗后缺血心肌组织中干细胞的数量。据此推测,缺血组织的局部微环境的改变可能对干细胞的动员、归巢和局部分化及生存力有重要影响。结论和创新点本研究发现,瑞舒伐他汀(5mg/kgQD)口服治疗能够促进大鼠急性心梗后心肌组织修复,显著改善心梗后心脏功能,这一作用与以下机制有关：1.瑞舒伐他汀治疗能减少心肌梗死后纤维疤痕组织增生,缩小梗死面积,改善左心室重构,保护心梗后左室收缩功能。2.瑞舒伐他汀治疗能调控和优化心梗后个体内环境和心肌局部微环境。瑞舒伐他汀通过上调SDF-1在血清以及心肌组织中的表达,同时下调CXCR-4、HIF-1α、ICAM-1和VEGF等细胞因子在心肌组织的表达,维持组织修复和心肌重构之间的平衡。3.瑞舒伐他汀调控缺血微环境的作用时间窗位于急性心梗后1周左右,其调控作用在缺血心肌组织较非缺血心肌组织更为显著。4.瑞舒伐他汀治疗有利于干细胞的动员,增加CD90+、c-kit+以及CD133+细胞在缺血损伤心肌组织中的数量,促进血管新生。本课题描述了急性心梗后SDF-1/CXCR-4通路、HIF-1α、VEGF、ICAM-1等细胞因子在大鼠外周血以及心肌组织不同部位的表达情况,首次报道了上述细胞因子在急性心梗后表达水平的时态性和区域性特点,探索了心肌急性缺血损伤后细胞因子应答机制。本课题通过研究瑞舒伐他汀体内干预对大鼠急性心梗后外周血以及心肌组织不同部位的SDF-1/CXCR-4通路、HIF-1α、VEGF、ICAM-1等细胞因子表达水平的影响,首次报道了瑞舒伐他汀体内干预对急性心梗后个体内环境和局部微环境的调控作用,以及其调控作用的时态性和组织区域性特点。本课题首次提出瑞舒伐他汀体内干预促急性心梗后组织修复的可能机制。本研究证实瑞舒伐他汀可通过多条通路,如上调SDF-1,动员干细胞,抑制细胞因子过度反应,减少纤维增生和疤痕形成,以及改善心室重构等机制,保护心梗后心脏功能,为探索他汀类药物促进缺血心肌组织修复的可能机制以及最佳干预时间和条件提供了实验依据。
【作者】胡昕婴；
【导师】葛均波；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2011，博士
【关键词】瑞舒伐他汀；心肌梗死；细胞因子；心脏重构；组织修复；炎症反应；干细胞治疗；

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