TLR4在肝细胞癌中表达活化后对细胞增殖的影响及其相关机制研究

【摘要】肝细胞癌是威胁人类生命的常见的恶性肿瘤之一,患者预后差并有较高的致死率。肝细胞癌是典型的与慢性炎症状态相关的肿瘤,常发生于脂肪肝、酒精性肝病和肝炎、病毒性肝炎导致的肝硬化基础上。TLR4是表达于免疫细胞和上皮细胞,能在内、外源性配体分子的作用下活化细胞内MyD88依赖和MyD88非依赖信号转导,通过NF-κB途径和MAPK途径启动炎症因子基因转录。不仅在细胞应对外源性感染、组织损伤修复中有重要作用,异常活化后还促进肿瘤的发生和发展。正常肝细胞能表达TLR4,而且肝脏疾病时血循环中内毒素水平常有升高,活化TLR4,在酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化中都有促进作用。因此我们推测TLR4在肝细胞癌的发生、发展中也可能有重要作用。本课题试图从肝细胞癌细胞株和人肝细胞癌组织两个水平对TLR4被活化后对癌细胞增殖能力的影响及其对细胞内信号转导途径的调控作用进行探讨。第一部分TLR4在肝细胞癌细胞株中的表达及其活化后对细胞增殖的影响目的检测TLR4在永生化肝细胞L02、肝细胞癌HepG2和肝细胞癌PLC三个细胞株中的表达及LPS刺激活化后对细胞增殖、凋亡的影响。方法Westernblot检测TLR4蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果与永生化肝细胞L02相比,TLR4在肝细胞癌细胞株HepG2和PLC中的蛋白表达上调。LPS刺激细胞后,在L02和PLC两个细胞株中,24小时前L02和PLC有细胞增殖减弱,细胞凋亡增多,GO到G1期细胞百分比刺激组较无刺激对照组增高,而G2期到M期细胞百分比降低；24小时后则三个细胞株刺激组细胞的增殖都比非刺激对照组增强。小结TLR4在癌细胞中上调表达,活化后能促进癌细胞增殖。第二部分LPS刺激活化TLR4后对肝细胞癌细胞胞内信号转导的影响目的观察刺激活化TLR4后,细胞株中信号转导途径活性的变化,了解肝癌细胞中TLR4调控细胞蛋白表达的机制。方法Westernblot检测LPS刺激活化TLR4后细胞株中MAPK途径和NF-κB途径的活化状态。结果LPS刺激15分钟和30分钟后,L02和PLC中I-κB磷酸化水平较对照组明显升高(P<0.05),但HepG2中IκB-α磷酸化水平在刺激15分钟时降低,在60分钟时明显上升。L02和PLC中磷酸化JNK水平也在LPS刺激15分钟时即已明显升高。HepG2中磷酸化JNK水平在30分钟时显著升高。磷酸化p38在L02中表达水平有升高,而在HepG2(P<0.05)和PLC中却下降。磷酸化ERK水平在L02(P<0.05).HepG2和PLC(P<0.05)均在刺激后短暂性升高。小结LPS刺激经TLR4介导的急性细胞应激早期通过活化JNK、ERK和NF-κB途径抑制细胞死亡、促进细胞存活,而稍晚的NF-κB途径活化则能通过诱导炎症因子的表达促进细胞增殖。第三部分TLR4在肝细胞癌组织中的表达及与临床病理指间的关系目的检测TLR4在人肝细胞癌组织中的表达及其与临床病理指标间的相关性。方法采用免疫组织化学法对61例肝细胞癌病例TLR4表达,并对TLR4表达与临床病理指标间的关系进行统计学分析。结果TLR4主要表达在细胞浆内。在正常肝细胞中弱阳性表达,但在肝细胞癌癌细胞和癌旁肝细胞部分病例中有表达增强。肝细胞癌癌细胞中有29.5%的病例表达评分是2级,9.8%的病例表达评分达到3级。统计学分析显示TLR4表达与肝细胞癌分级、肿瘤直径、p53、HBsAg和HBcAg均无相关性,而与年龄呈正相关(r=0.287,P<O.05)。小结TLR4在肝细胞癌中的表达较正常肝细胞有上调提示其可能参与肿瘤的进展。
【作者】王李莉；
【导师】朱虹光；
【作者基本信息】复旦大学，病理学与病理生理学，2011，博士
【关键词】Westernblot；MTT；流式细胞术；LPS；TLR4；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期；细胞信号转导；MAPK途径；NF-κB途径；肝细胞癌；免疫组织化学；

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