NOS抑制物ADMA对急性卒中预后的评估及神经保护的可能机制

【摘要】非对称性二甲基精氨酸(asymmetricdimethylarginine,ADMA)是内源性非选择性一氧化氮合酶(nitricoxygensythase,NOS)抑制剂,存在于人体内所有有核细胞中,可抑制体内一氧化氮(nitricoxygen,NO)的合成。ADMA可抑制内皮型NOS(endothelialNOS,eNOS)的活性,导致外周血管舒张功能受损,脑血流灌注下降,可能影响缺血性卒中患者的康复；然而,针对ADMA抑制神经元型NOS(neuronalNOS,nNOS)及诱导型NOS(inducibleNOS,iNOS)的活性,ADMA则抑制了由iNOS及iNOS介导的神经毒性作用,推测卒中后ADMA可能具有神经保护作用。那么,作为一个整体,ADMA通过影响不同NOS的作用,最终对卒中患者预后有何影响,从临床到机制的研究尚无定论,尤其是卒中患者体内ADMA与卒中预后之间有无相关性,既往未见类似的研究。本研究通过临床队列与相应的细胞模型探索ADMA与缺血性卒中的相关性以及可能的机制：1、建立超急性期缺血性卒中患者队列,检测其外周血ADMA浓度,并随访卒中后90d的改良Rankin评分(modifiedRankinScale,mRS),了解卒中后外周血ADMA浓度与卒中预后的相关性；2、通过体外培养大鼠神经元细胞,建立糖氧剥夺(oxygenglucosedeprivation,OGD)模型模拟体内缺血性卒中过程,探讨ADMA对OGD后神经元细胞的保护作用来间接了解缺血性卒中发生后神经元细胞周围的ADMA对神经元细胞的保护作用；3、通过大鼠神经元OGD模型初步探讨ADMA对OGD后神经元细胞保护作用的机制。第一部分急性缺血性卒中患者外周血ADMA水平与卒中预后相关性研究目的了解缺血性卒中患者超急性期外周血ADMA水平的变化趋势及其与卒中预后的相关性；了解缺血性卒中超急性期外周血ADMA浓度与炎症水平的相关性。我们还分析了ADMA的同系物对称性二甲基精氨酸(symmetricdimethylarginine,SDMA)及精氨酸(arginine,Arg)与卒中预后的相关性。方法本研究中共入组67例急性缺血性卒中患者及32例健康对照。所有病例均为发病6h以内的缺血性卒中患者,伴有头颅CT或MRI等影像学上明确的与本次发病部位对应位置的缺血灶；排除标准包括：一过性脑缺血发作(transientischemicattack,TIA)、脑出血、恶性肿瘤、伴发严重感染性疾病、系统性风湿性疾病。健康对照组来源于卒中患者的健康家属。采集所有患者卒中起病后6h、12h、24h、3d及7d的外周血标本。外周血ADMA、SDMA及Arg浓度采用高效液相色谱质谱串联方法进行检测。外周血炎症指标单核细胞趋附因子-1(monocytechemoattractantprotein-1,MCP-1)、金属基质蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases,MMP-9)及组织型金属机制蛋白酶抑制物-1(Tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase-1,TIMP-1)采用ELISA方法检测。高敏CRP(highsensitiveC-reactiveprotein,hsCRP)及白介素-6(interleukin-6,IL-6)通过比浊法进行检测。预后评价指标为卒中后90d的mRS评分,mRS0-1分为良好预后,mRS2-6分为不良预后。卒中后不同时间点ADMA、SDMA及Arg浓度的差别采用repeatedmeasurement统计方法进行统计。ADMA浓度与卒中预后相关性采用多元回归分析方法。外周血ADMA浓度与炎症指标之间的相关性采用Pearson或Spearman;相关分析。结果缺血性卒中超急性期各研究时间点外周血ADMA浓度均明显高于健康对照组,p<0.05；而SDMA及Arg浓度与健康对照组相比无明显差异。急性卒中患者超急性期外周血ADMA及SDMA浓度均随时间推移升高,ADMA在卒中后3d达高峰,此后开始下降；SDMA浓度则在卒中后24h内迅速上升,直至3d维持在较高水平。虽然卒中后外周血Arg浓度下降趋势,但无统计学意义。血浆ADMA浓度变化时间曲线与卒中严重程度相关。中度及重度卒中外周血ADMA浓度在卒中后7d仍保持在较高水平,而轻度卒中外周血ADMA浓度3d达高峰,7d即可见明显下降(p=0.048)。卒中后24hSDMA浓度>0.591umol/L,卒中后3dADMA浓度≥0.566umol/L及7dADMA浓度≥0.530umol/L均提示缺血性卒中患者卒中后90d预后不良。卒中后24h外周血SDMA浓度与MMP-9正相关,卒中后3d外周血ADMA浓度与IL-6及hsCRP等急性时相蛋白呈正相关,卒中后7dADMA浓度除了与IL-6及hsCRP呈正相关外,还与MCP-1及TIMP-1呈正相关。结论缺血性卒中超急性期外周血ADMA及SDMA浓度可作为提示卒中预后的生物化学指标。卒中后外周血ADMA及SDMA的表达与炎症水平相关。第二部分ADMA神经保护作用的研究目的研究ADMA对OGD缺氧复氧诱导神经元损伤的影响,探讨ADMA对OGD后神经元细胞内NO水平的影响。方法取体外培养7d的大鼠神经元细胞,随机分成对照组、OGD组、不同浓度ADMA(3-300uM)干预OGD组。根据实验分组,对照组不给予任何干预措施；OGD组给予OGD干预1.5h后复氧0-24h；不同浓度ADMA干预OGD组为在OGD前24h分别给予3uM、10uM、30uM、100uM及300uM的ADMA预处理,并且在OGD及复氧2h过程中保持ADMA浓度不变。神经元损伤评价方法：1.神经元细胞免疫组化染色观察神经元细胞形态学变化；2.测定细胞上清液中LDH含量评价神经元损伤程度。细胞内NO水平检测采用NO检测荧光探针DAF-FMDA,在荧光酶标仪上激发波长495m、发射波长515nm处检测细胞内荧光探针的相对荧光单位(relativefluorescentunit,RFU),计算细胞内NO的相对含量。结果与对照组相比,OGD缺氧复氧诱导神经元LDH释放率为时间依赖性升高。OGD缺氧复氧后神经元形态发生变化：神经元胞体肿胀或皱缩,神经元轴突断裂,部分可见轴突呈串珠样改变,甚至轴突消失。ADMA干预OGD组神经元LDH释放率显著低于OGD组(p<0.01),但是下降程度无ADMA浓度依赖关系。神经元细胞免疫组化结果：与OGD组相比,30uMADMA干预OGD组神经元形态保持相对完整。与对照组相比,OGD组细胞内NO水平升高(p<0.05);30uMADMA干预OGD组复氧0-24h,多数观察时间点神经元细胞内的NO水平与OGD组无显著差异(p>0.05)。结论ADMA可减少OGD缺氧复氧诱导的神经元损伤,起到神经保护作用,这种保护作用不依赖于ADMA对神经元NO水平的抑制作用。第三部分ADMA神经保护作用可能机制初步探讨目的研究缝隙连接蛋白-36(connexin36,cx36)在OGD缺氧复氧过程中表达的变化,初步探讨cx36在ADMA神经保护过程中的作用。方法取体外培养7d的大鼠神经元细胞,随机分成对照组、OGD组、及ADMA干预OGD组。对照组不给予任何特殊干预；OGD组给予OGD1.5h后复氧0-24h；ADMA干预OGD组为OGD处理前24h给予30uMADMA干预,并在之后的实验过程中保持该浓度不变。采用Westernblot方法检测不同处理组神经元细胞cx36的表达情况。采用荧光黄染料负荷实验评估各组神经元细胞的缝隙连接介导的细胞通讯(Gapjunctionintercellularcommunication,GJIC)功能。结果OGD缺氧复氧后0-24h,神经元细胞cx36表达量逐渐增加,复氧4h、12h及24hcx36表达量显著高于正常对照组(p<0.05)。与单纯OGD缺氧1.5h复氧4h的神经元相比,经30uMADMA预处理的神经元在同样的OGD条件下cx36的表达量下降(p<0.05)。荧光黄染料负荷实验发现,对照组仅分布在划痕两侧的神经元有荧光黄染料浸润；OGD组除划痕两侧邻近细胞有荧光黄染料的浸润外,稍远离划痕的神经元细胞亦有荧光黄染料浸润；ADMA干预OGD组荧光黄染料浸润情况与对照组相似。结论ADMA可下调OGD缺氧复氧诱导的cx36表达增加及GJIC功能增高,提示对cx36的调控是ADMA神经保护作用的其中一个可能机制。结论1.缺血性卒中后外周血ADMA浓度升高。症状严重程度不同,ADMA浓度的时间变化趋势亦不同。2.缺血性卒中急性期外周血ADMA及SDMA浓度可提示卒中后90d预后,ADMA及SDMA浓度越高,卒中预后越差。3.缺血性卒中急性期外周血ADMA及SDMA浓度与炎症指标有相关性。3.ADMA可减轻OGD缺氧复氧诱导的神经元细胞损伤,有神经保护作用。4.ADMA可下调OGD后神经元cx36的表达,同时还可抑制OGD后GJIC功能,提示ADMA神经保护作用其中一个可能机制是通过对cx36的调控来实现的。
【作者】陈淑芬；
【导师】董强；
【作者基本信息】复旦大学，神经病学，2011，博士
【关键词】脑梗死；非对称性二甲基精氨酸(ADMA)；对称性二甲基精氨酸(SDMA)；卒中预后；糖氧剥夺模型(OGD)；缝隙连接蛋白-36(cx36)；缝隙连接介导的细胞通讯(Gapjunctionintercellularcommunication；GJIC)；神经保护；

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