沉寂信息调节因子（SIRT1）在肾脏缺血—再灌注损伤中作用的研究

【摘要】研究目的：急性肾损伤(AKI)是临床常见的危急重症,肾缺血-再灌注导致的急性肾小管坏死是引起AKI的主要原因。虽然在过去的三、四十年对于AKI的病理生理研究取得了显著进展,血液净化技术也不断得到改善,目前临床上仍缺乏有效的针对性治疗,死亡率居高不下(仍达50%)。不仅如此,流行病学资料显示,随着年龄的增加,无论是AKI的发生率还是病变严重程度都显著增高。也就是说,应激或疾病,如缺血-再灌注,可导致肾脏的早发衰老。沉寂信息调节因子(SIRT1)因与代谢、应激反应及寿命调节息息相关而倍受关注,在哺乳动物中,越来越多的研究证实SIRT1是细胞抵御外界应激的一个关键因子。本研究旨在小鼠中探讨SIRT1在急性肾损伤中的作用及其可能机制。方法：本研究共包括三组小鼠实验,分别为1)不同年龄的CD1小鼠,包括：年轻小鼠(7-8周龄)接受假手术(YNGSham),年长小鼠(18-22周龄)接受假手术(ADTSham),年轻小鼠(7-8周龄)接受肾脏缺血-再灌注手术(YNGI-R),年长小鼠(18-22周龄)接受肾脏缺血-再灌注手术(ADTI-R);2)年长小鼠(18-22周龄)随机分为SIRT1激动剂(SRT-1720)组或安慰剂Vehicle对照组；3)采用基因敲除技术构建杂合子的SIRT1基因敲除SIRT1+/-与野生型SIRT1+/+小鼠。肾脏中SIRT1的检测通过免疫印迹、实时定量PCR和免疫组化方法完成。通过钳夹小鼠双侧肾蒂45分钟建立急性肾损伤模型,分别从功能学(血肌酐、尿素氮)、形态学(肾脏病理)方面观察不同SIRT1表达水平的小鼠对于损伤的耐受程度,同时检测细胞凋亡(TUNEL法,cleavedcaspase-3)及增生相关指标(PCNA免疫组化及免疫印迹)；并对凋亡及增生相关基因进行检测(包括Bax、Bcl-2、p53、p21)以探索其可能作用机制。结果：经过45分钟肾脏缺血后,无论年轻或年长小鼠都出现肾小管坏死,但年轻小鼠的损伤程度远低于年长小鼠。在缺血-再灌注手术24小时后,年轻小鼠血尿素氮明显低于年长小鼠(YNGI-R38.6±6.8vsADTI-R190.9±20mg/dL,P<0.001);在术后48小时,年轻小鼠尿素氮已恢复到接近正常,而年长小鼠血尿素氮仍维持在非常高的水平(183.9±35to27.3±3.3mg/dL,ADTI-RvsYNGI-R,P<0.001)。年轻小鼠血肌酐的上升程度也低于年长小鼠(YNGI-R0.23±0.04vsADTI-R1.34±10.3mg/dL,P<0.001)。另外年轻鼠肾小管损伤指数(0.31±0.07vs0.91±0.12皮质；0.82±0.07vs2.44±0.24外髓,P<0.001)以及肾脏中凋亡细胞均明显低于年长鼠。然而年轻鼠肾脏中细胞增生则明显多于年长鼠。在假手术组,无论是年长小鼠还是年轻小鼠,均未出现肾脏病变。在肾脏组织中,SIRT1表达非常广泛,包括肾小管上皮细胞、间质细胞、血管平滑肌细胞等,分布上髓质多于皮质。在基础状态下,年轻小鼠SIRT1蛋白表达量高于年长小鼠(YNGSham1.42±10.2vsADTSham0.98±10.3P<0.05);在缺血-再灌注后,SIRT1的表达量在年长小鼠中无明显改变,而在年轻小鼠中则显著升高(YNGI-R2.22±10.3vsADTI-R1.03±10.2P<0.01)o给予年长小鼠SRT1720(SIRT1激动剂)后,再灌注损伤的严重程度降低,表现为血肌酐下降(0.44±10.04mg/dLvs0.80±10.16mg/dL,SRTvsVehicle,P<0.05)及肾小管损伤指数的降低(1.58±0.14vs2.06±0.15外髓,SRTvsVehicle,P<0.01)。同时伴有凋亡细胞减少(SRT16.8±10.6vsVehicle22.0±10.8TUNEL(+)细胞/HPF,P<0.001)和增生细胞增多(SRT41.2±2.9vsVehicle23.2±2.7PCNA(+)细胞/HPF,P<0.01)。相反,利用基因敲除技术构建的SIRT1+/-小鼠,较之野生型SIRT1+/+小鼠,其肾脏SIRT1蛋白与mRNA水平均降低,再灌注损伤后血肌酐明显高(0.75±0.11mg/dLvs0.47±10.06mg/dL,SIRTl+/-vsSIRTl+/+,P<0.05),小管损伤指数亦增高(1.61±10.14vs1.08±10.10外髓,SIRT1+/-vsSIRT1+/+,P<0.001)。在SIRT1缺失的肾脏组织中,损伤介导的细胞凋亡增多(SIRT1+/-38.112.4vsSIRT1+/+27.8±11.8TUNEL(+)细胞/HPF,P<0.01),增生的小管上皮细胞减少(SIRT1+/-37.9±13.2vsSIRT1+/+49.1±13.9PCNA(+)细胞/HPF,P<0.05)。实验小鼠肾脏p53表达水平与肾脏SIRT1蛋白表达水平呈负相关,年长小鼠p53的表达量远高于年轻小鼠(ADTI-R2.310.4vsYNGI-R0.910.4P<0.05);外源性给予年长小鼠SIRT1激动剂,在提高SIRT1水平的同时,也降低了p53的表达水平,约为安慰剂组的1/2(P<0.01)；利用基因敲除技术构建的SIRT1+/-小鼠,其SIRT1表达量明显降低的同时,p53的表达水平显著提高。p21在各组之间的表达趋势与p53类似,表现为SIRT1高表达的小鼠中p21蛋白表达水平较低。结论：在年龄相关的缺血-再灌注性急性肾损伤严重程度差异中,SIRT1具有关键作用,随着年龄增加,肾脏SIRT1水平下降与缺血再灌注损伤易感性增加有关。下调SIRT1加重肾脏损伤,SIRT1激动剂SRT-1720对肾脏缺血-再灌注损伤具有保护作用,进一步支持SIRT1水平与肾脏损伤的关系。SIRT1可通过减少细胞凋亡,增加应激状态下细胞的存活和增殖能力,从而起到有效保护作用。进一步研究提示SIRT1对p53的抑制是其抗损伤作用的重要机制。总之,SIRT1是一种重要的存活因子；在肾脏缺血-再灌注损伤及其所诱发的细胞衰老中,SIRT1是临床治疗一重要的潜在靶点。
【作者】范虹；
【导师】郝传明；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2011，博士
【关键词】沉寂信息调节因子(SIRT1)；急性肾损伤(AKI)；缺血-再灌注(I-R)；早熟衰老；凋亡；细胞增殖；

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