犬贾第虫microRNAs的克隆与鉴定

【摘要】MicroRNAs（miRNAs）是一类大小在19-24nt范围内的非编码小分子RNAs，它们在细胞增殖、分化、凋亡、应激等细胞过程中起重要的调控作用。miRNAs一般通过碱基完全配对或不完全配对与其靶标相互作用，导致靶标mRNAs降解或翻译抑制，从而引发基因翻译后沉默。目前对于贾第虫的分子生物学特性，尤其基因调控机理方面还不是很清楚。由于贾第虫mRNA的5’和3’非编码区都很短，只有几十甚至十几核苷酸，使贾第虫在转录水平上调控基因的几率大大减小。另一种基因调控是转录后调控，其中之一是由miRNAs介导的转录后翻译抑制调控。至今，已经确定贾第虫体内有产生miRNAs必需的Dicer酶和miRNAs行使功能必需的Ago蛋白，表明了贾第虫体内miRNAs调控机制的存在。目前已报道贾第虫中存在6个具有活性的miRNAs：miR2,miR3,miR4,miR5，miR6和miR10。其中，miR3明显抑制histoneH2A的表达，miR5具有21个潜在靶标，但是具体靶标不明确，而miR2,miR4,miR6和miR10则均参与VSPs基因的调控，表明miRNAs可能在免疫逃避等关键生理过程中起着重要的作用。为了获取更多关于贾第虫miRNAs的信息，本研究以犬贾第虫为研究对象，首先通过加尾反转录法构建cDNA文库，从中克隆筛选到74个小分子RNAs（19-24nt）；通过Blast软件对74个小分子RNAs的基因进行定位，挑选出14个位于转录区的基因作为初步候选基因。然后，利用RNAstructure软件分析小分子RNAs基因与上下游序列之间形成的二级结构，选取能形成茎环结构的基因作为候选基因。最终得到三个候选miRNAs。然后，通过实时荧光定量PCR、DSLE法、引物延伸和Dicer体外切割实验对候选miRNAs进行鉴定，最终得到两条miRNAs：GmiR-6和GmiR-9。另外，本研究还利用荧光素酶报告系统验证了GmiR-6和GmiR-9的活性，结果显示GmiR-6能抑制带有靶标序列的luc2基因的表达达86.5%，而GmiR-9的抑制率能达到92.7%。最后，利用miRNAs靶标预测软件miRanda寻找两个miRNAs在病毒基因组中的潜在靶标，分析结果显示GmiR-6在贾第虫病毒基因组上有两个潜在靶标，均位于衣壳蛋白编码区，表明贾第虫编码的miRNAs可能参与了贾第虫与贾第虫病毒之间相互作用的调控，为以后深入研究贾第虫miRNAs调控机理及功能奠定了基础。
【作者】吴威；
【导师】张西臣；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】犬贾第虫；microRNAs；cDNA文库；克隆；鉴定；

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