Thermotoga naphthophila RUK-10嗜热糖苷酶的表达与应用

【摘要】糖苷类化合物（glycosidecompounds）在自然界中广泛存在，普遍存在于动物、植物和微生物中。通常，它们在许多生物学过程中扮演重要角色，如细胞间的相互作用；一些糖苷类化合物因具有药理活性而成为近年来的研究热点，如人参皂苷、熊果苷和红景天苷等。糖苷水解酶（Glycosidehydrolases，EC3.2.1.-）分布广泛，能够水解二糖或多糖之间的糖苷键，也可以水解糖与非糖部分形成的糖苷键。一些糖苷酶不仅具有水解活力，同时还具有转糖苷活力，能够将糖基转移到醇类、糖类或其它化合物上从而形成烷基糖苷、多糖及其它糖苷类化合物。近年来，人们对嗜热微生物来源的糖苷酶非常感兴趣，嗜热酶不仅在热稳定上具有优势，在进行催化反应时同样有许多优势，如较高的反应温度可以提高反应起始速率，增强底物的溶解性，同时还可以防止微生物污染。在本研究中，我们从嗜热细菌ThermotoganaphthophilaRUK-10（最适生长温度为80oC）中克隆出两个嗜热糖苷酶，β-半乳糖苷酶Tnap1577和β-葡萄糖苷酶Tnap0602。两个酶均在E.coliBL21(DE3)中实现了可溶表达，重组表达后的酶在N端带有His标签，经过纯化得到了纯度较高的目的蛋白，并对酶学基本性质进行了表征。β-半乳糖苷酶Tnap1577水解邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（oNPGal）和乳糖的最适反应温度分别为90和70oC，最适反应pH分别为6.8和5.8。热稳定性研究表明Tnap1577（0.2mg/ml）在75、80、85和90oC下的半衰期分别为10.5、4、1和0.3h。动力学研究表明Tnap1577在80oC条件下水解oNPGal的Km和Vmax值分别为1.31mM和3385.67μmolmin-1mg-1。在70oC条件下水解乳糖的Km和Vmax值分别为1.43mM和2.67μmolmin-1mg-1。β-葡萄糖苷酶Tnap0602不仅具有β-葡萄糖苷酶活力，同时还具有β-半乳糖苷酶活力。Tnap0602水解对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（pNPGlu）和oNPGal的最适反应温度均为95oC，最适反应pH均为7.0。其水解乳糖的最适反应温度和pH分别为85oC和5.5。热稳定性研究表明Tnap0602（0.2mg/ml）在75、80、85和90oC下的半衰期分别为84、32、14和3h，pH稳定性研究表明Tnap0602在pH5.0-10.0的范围内有较好的稳定性。Tnap0602在80oC的条件下水解pNPGlu和oNPGal的Km值分别为0.13mM和0.63mM，Vmax值分别为18389.10和6250μmolmin-1mg-1。在85oC条件下水解乳糖的Km和Vmax值分别为0.04mM和28.03μmolmin-1mg-1。Tnap1577和Tnap0602均为同源二聚体，其单体的分子量分别为70和51kDa，且两个酶均具有转糖苷的活力。在乳糖为糖基供体，烷基醇类为糖基受体的醇/水两相反应体系中，Tnap1577可进行转糖苷反应催化丁基-半乳糖苷、己基-半乳糖苷和辛基-半乳糖苷的合成。Tnap0602可在只有乳糖作为转糖苷底物的单水相体系中催化低聚半乳糖的合成。我们的研究结果表明β-半乳糖苷酶Tnap1577和β-葡萄糖苷酶Tnap0602不仅在乳糖水解方面，同时在糖苷类化合物合成方面均具有潜在的工业应用价值。
【作者】孔繁思；
【导师】高仁钧；解桂秋；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】β-半乳糖苷酶；β-葡萄糖苷酶；嗜热酶；Thermotoganaphthophila；转糖苷；

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