六邻体嵌合型重组5型腺病毒载体复制和包装机理的研究

【摘要】重组5型腺病毒(recombinantadenovirustype5,rAd5)作为基因治疗和疫苗载体具有多重优势，然而，预存免疫的存在会显著的降低该种血清型腺病毒载体的转导效率以及转基因表达水平，限制腺病毒作为疫苗以及基因治疗载体的应用。利用基因工程改造腺病毒载体，将rAd5表面主要结构蛋白六邻体的7个高突变区(HVR区)选择性地与稀有血清型六邻体的相应区域相嵌合是帮助rAd5逃避预存免疫的有效方法。限制这一方法的主要问题是这种嵌合改造过程繁琐，而且与rAd5相比，许多嵌合改造的方案都降低了嵌合型腺病毒的包装效率和复制水平，甚至导致改造后的腺病毒不能包装。与此相关的病毒复制和包装机理有待进一步的研究。本论文在课题组前期工作的基础上，首先通过对几种与人D亚群腺病毒(37型、43型)六邻体HVR区嵌合的重组5型腺病毒[Ad5-GFP、Ad5-37(5,7)-GFP、Ad5-43(5,7)-GFP]复制水平的分析，以及对几种六邻体嵌合型重组5型腺病毒骨架质粒[Ad5、Ad5-37(5,7)、Ad5-43(5,7)、Ad5-37(1-7)、Ad5-43(1-7)]蛋白表达量的检测发现，对腺病毒六邻体的改造影响了六邻体在细胞内的丰度和聚集状态，最终导致嵌合腺病毒的复制水平和包装效率的降低。接着，为了更深入地了解嵌合改造的腺病毒六邻体对其生物活性的影响，我们构建了相应的几种嵌合型六邻体的真核表达质粒[5Hexon、5Hexon-37(5,7)、5Hexon-37(1-7)、5Hexon-43(5,7)、5Hexon-43(1-7)]，检测了几种嵌合型六邻体与其伴侣蛋白5型腺病毒L4-100K(5-100K)的相互作用。通过对5-100K对六邻体表达量、形成三聚体及进入细胞核三个方面的影响进行检测，我们发现，虽然嵌合改造后的5型腺病毒六邻体都能够在5型L4-100K的帮助下提高表达量，但是不同的改造方案却不同程度地影响了嵌合六邻体在5型L4-100K的帮助下形成三聚体的效率以及进入细胞核的效率，而这些改变也和嵌合型腺病毒包装重组效率以及复制水平的改变是一致的。最后，我们将5型L4-100K(5-100K)更换成D亚群L4-100K(D-100K)，并重新检测了D-100K与几种嵌合型六邻体[5Hexon-37(1-7)、5Hexon-43(1-7)]的相互作用，发现血清型特异性在嵌合型六邻体形成三聚体的过程中并不是主要影响因素，进一步确定了HVR区嵌合对腺病毒六邻体自身形成三聚体的稳定性造成影响，从而改变了嵌合型腺病毒包装重组效率和复制水平。本论文的研究表明，对腺病毒六邻体的嵌合改造影响了六邻体自身形成三聚体的稳定性，使得嵌合六邻体在其伴侣蛋白L4-100K的帮助下形成三聚体和进入细胞核参与组装的效率改变，是六邻体的嵌合改造影响腺病毒包装效率和复制水平的主要原因，并且阐明了相关的腺病毒包装机理。另外，通过本论文的研究，我们建立了一种新的有效评价六邻体嵌合方案的平台，即通过检测六邻体与L4-100K相互作用来评价和预测嵌合改造腺病毒六邻体的策略对病毒包装复制影响的快速有效方法。通过该方法能够有效排除影响腺病毒包装复制的嵌合改造方案，大大提高了对腺病毒六邻体进行改造后得到六邻体嵌合型重组腺病毒的成功率。
【作者】董嘉宁；
【导师】于湘晖；
【作者基本信息】吉林大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】重组腺病毒载体；六邻体嵌合；L4-100K；HVR；

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