抗ESAT-6单克隆抗体靶向探针对结核影像诊断的初步研究

【摘要】第一部分碘与荧光标记抗ESAT-6单克隆抗体靶向探针的制备及免疫活性评价目的制备抗结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的单克隆抗体,以碘原子和荧光标记单克隆抗体研制CT和荧光靶向探针,并评价两种探针的免疫活性。方法1.以重组大肠杆菌表达纯化的ESAT-6蛋白为免疫原免疫小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术,获得了4株针对结核分枝杆菌ESAT-6抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,进行小鼠腹水制备、纯化,并测定抗体纯度和效价。2.采用Iodogen法,以放射性碘Na125I示踪非放射性碘Na127I标记抗ESAT-6单克隆抗体,纸层析法测定放化纯度和稳定性。3.将抗ESAT-6单克隆抗体偶联两种荧光基团IR783和罗丹明制备荧光探针,SDS-PAGE凝胶电泳确定荧光探针表征。4.间接ELSIA法测定碘原子与荧光标记探针的抗体效价,评价标记后探针免疫活性。结果1.4株单克隆抗体的腹水效价达到1：128000,纯化后抗体纯度高于90%,抗体亚型均为IgGl/k型。ELISA结果显示制备的单克隆抗体与结核分枝杆菌ESAT-6抗原可发生特异反应,而不与非相关性蛋白His-85b发生反应。2.纯化后的碘原子标记抗ESAT-6抗体的放化纯度大于98%。稳定性试验测定结果显示,放射性碘标记抗ESAT-6抗体在体外4℃条件下存放一周后放化纯度大于95%。3.荧光探针每个抗体分子上标记2个IR783和1.5个罗丹明。采用不同色调分析方式进行处理,显示探针无杂条带。4.标记后单克隆抗体仍能与ESAT-6抗原发生特异性反应,抗体效价大于1：128000,碘原子和荧光标记探针具有较强免疫活性。结论1.制备了高纯度、高效价抗结核分枝杆菌ESAT-6单克隆抗体,可与ESAT-6蛋白产生特异性反应。2.碘原子标记抗ESAT-6单克隆抗体具有较好的体外稳定性；荧光探针纯度优良。碘与荧光标记抗ESAT-6单克隆抗体能与ESAT-6抗原特异性结合,较好保持其免疫活性。为进一步应用于动物体内成像实验奠定了基础。第二部分小鼠肺结核模型建立及ESAT-6抗原在小鼠肺结核组织中的表达目的探讨滴鼻途径建立C57BL/6J小鼠肺部结核分枝杆菌感染模型的可行性,分析ESAT-6抗原在小鼠肺结核组织中的表达和意义。方法1.C57BL/6J小鼠30只,分为感染组24只,对照组6只。结核分枝杆菌H37Rv标准株滴鼻法接种感染组小鼠,对照组小鼠给予同等剂量生理盐水。2.感染后4周、8周、12周,Micro-CT扫描小鼠肺部评价肺部病灶变化,并与HE染色及抗酸染色病理对照分析,小鼠肺组织匀浆培养计算肺部结核分枝杆菌菌落数。3.应用免疫组化及免疫荧光染色法检测ESAT-6抗原在小鼠肺结核组织中的表达。结果1.感染后4周、8周、12周,小鼠肺组织匀浆培养结核分枝杆菌菌落计数在106CFU左右,呈轻度上升趋势；小鼠肺部Micro-CT扫描显示肺部病灶阳性率分别为50.0%、83.3%、100%,肺部病灶体积增加与时间递增相关(P<0.05)；3个监测时间点小鼠肺部病理学检查阳性率分别为83.3%、100%、100%。感染后8周、12周两个时间点小鼠肺部Micro-CT扫描阳性率及病理阳性率相似,病理改变均以增殖性实变和肉芽肿为主,干酪样坏死少见。感染后4周、8周、12周,抗酸杆菌染色均可见病变区散在或大量结核分枝杆菌聚集。2.免疫组化结果显示感染后4周、8周、12周可见在小鼠肺结核渗出及实变区域片状褐色阳性物质沉积,在结核分枝杆菌及巨噬细胞分布区域见条状、颗粒状、结节状褐色阳性物质沉积。免疫荧光染色在实变区及肉芽肿区域荧光信号明显增强。结论1.Micro-CT动态观察与病理学对照分析表明经滴鼻感染途径成功建立了小鼠肺结核感染模型。2.感染后8周是成像实验模型建立的理想时间点。.3.免疫组化及免疫荧光观察表明ESAT-6抗原在小鼠肺结核组织中的表达明显增强,为进一步研究单克隆抗体探针靶向诊断小鼠肺结核提供了依据。第三部分小鼠肺结核Micro-CT和近红外荧光成像的实验研究目的探讨抗ESAT-6单克隆抗体靶向探针Micro-CT和近红外荧光成像诊断小鼠肺结核的可行性。方法1.24只C57BL/6J小鼠分为CT组和荧光组,每组12只。CT组和荧光组又分为实验组和对照组,实验组各9只小鼠,对照组各3只小鼠。小鼠经滴鼻法感染结核后8周用于成像实验。实验组经尾静脉注射碘和荧光标记单克隆抗体探针,对照组注射等量碘和荧光标记非特异IgG抗体。2.CT组6只小鼠注射探针前、注射探针后6h、24h、48h活体Micro-CT动态成像,测量不同时间点肺部病灶CT值并计算平均值；对照组小鼠相同时间点观察。CT组3只小鼠在注射探针24h后,放射性活度仪检测肺部病灶及周围正常组织放射性碘分布。3.荧光组9只小鼠注射荧光探针后24h,取小鼠肺、心、肝、脾、肾、肌肉组织离体近红外荧光成像。测量肺部病灶、正常肺组织、背景噪声信号强度(SI),计算对比噪声比(CNR),CNR=(SI病灶-SI正常肺)／SI背景噪声。肺组织冰冻切片荧光显微镜观察并与HE染色对照分析,评价荧光探针到达结核病灶的能力。对照组小鼠相同方法观察。结果1.注射碘标记抗ESAT-6靶向探针后,Micro-CT小鼠肺部动态增强显示肺部结核病灶强化,且24h时CT值最高。对照组小鼠肺部病灶未见强化。放射性活度仪检测实验组小鼠肺部病灶放射性碘分布高于正常肺组织(P<0.05)。2.离体近红外荧光成像显示实验组小鼠肺部结核病灶区域荧光信号明显增强,对照组结核病灶区域微弱荧光或无荧光信号。单克隆抗体诱导的肺部病灶信号明显高于同型对照抗体,对比噪声比分别为60.33±3.44(n=9)和10.49±2.03(n＝3),两者存在统计学差异(P<0.05)。荧光显微镜显示荧光积聚区域与HE染色肺结核组织部位一致。结论1.活体Micro-CT成像显示碘原子标记探针能够靶向性聚集于结核病灶,放射性碘体内生物学分布与活体成像一致。2.离体近红外荧光成像及荧光显微镜观察证明了抗ESAT-6单克隆抗体荧光靶向探针可特异性到达小鼠肺结核组织。3.应用以上两种抗ESAT-6单克隆抗体探针可靶向、特异成像小鼠肺结核,为进一步多模式成像诊断肺结核奠定了基础。
【作者】冯峰；
【导师】张志勇；
【作者基本信息】复旦大学，影像医学与核医学，2013，博士
【关键词】结核分枝杆菌；杂交瘤；单克隆抗体；探针；滴鼻途径；肺结核；动物模型；Micro-CT；免疫组化；X线体层摄影术；荧光；靶向探针；

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