糖基化终末产物对miRNA-92b的影响及其在糖尿病肾病发病中的作用

【摘要】近年来一些研究显示microRNAs(miRNAs)在糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)发病中起重要作用，这种小RNA分子能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3’非编码区（untranslatedregions，UTR）特异性结合阻断mRNA的翻译或抑制该mRNA的蛋白合成，从而影响基因的表达调控，但是具体机制尚不清楚。而AGEs（advancedglycationendproducts，AGEs）做为DN的重要发病机制之一，其对miRNA表达情况无人研究。本实验首先采用miRNA芯片技术检测给予AGEs的大鼠肾脏miRNAs表达谱的变化，RealTime-PCR验证变化明显的miRNAs，最终确定miRNA的靶基因并阐明miRNA及其靶基因的作用机理。旨在从miRNA的角度探讨糖基化糖基化终末产物（AGEs）在大鼠DN发病中的作用。实验一AGEs动物肾损伤模型的构建采集正常大鼠血液分离血清，分别制成糖化血清（AGEs）和单纯血清（RSA）。实验大鼠随机分成3组：正常对照组（Control组）不施加任何处理；单纯血清组（RSA组）动物每日尾静脉注射单纯血清100mg/kg/次；AGEs组动物每日尾静脉注射AGEs100mg/kg/次，6w后检测各组大鼠肾损伤情况。结果显示RSA组与control组比较24h尿蛋白排泄率及肾组织结构无明显变化。AGEs组大鼠24h尿蛋白排泄率较RSA组和Control组有增高趋势，并且组织病理检查显示肾小球系膜细胞有轻度增生现象，肾小球区细胞外基质有增多及局部集聚的改变，提示AGEs组肾脏已开始出现类似DN的病变。实验二miRNA芯片初筛肾组织miRNA表达谱及Realtime-PCR验证本部分实验我们首先根据大鼠尿蛋白排泄率（UAE）结果挑选三只AGEs组及RSA组大鼠肾皮质部分进行miRNA芯片检测，初步筛查miRNAs表达谱变化，接下来挑选变化明显的miRNAs依次输入miRBase数据库，获取相应的miRNA序列信息和相关注释，再依次输入TargetScan数据库即可找到miRNA对应的靶基因（靶基因分为保守性和非保守型），我们根据与DN发病密切相关的细胞因子，锁定几个变化明显的miRNA，最后并利用realtime-PCR进行验证得出选定的miRNA。根据芯片结果我们发现，AGEs组和RSA检测共出9个表达谱变化明显的miRNAs(p<0.05)，分别为miRNA-7d-3p，miRNA-92b-3p，miRNA-181b-5p，miRNA-196c-5p，miRNA-7a-1-3p，miR-186-5p，miRNA-192-5P，miRNA-196b-5p和miRNA-345-5p，其中miRNA-92b-3p变化最明显且（p<0.01）。其次还有20多个miRNA的表达谱两组间也有差别（p<0.10），分别为miRNA-7c-1-3p，miRNA-129-5p，miRNA-7d-3p，miRNA-375-3p，miRNA-92b-3p，miRNA-7b-3p，miRNA-196b-5p，miRNA-181b-5p，miRNA-187-3p，miRNA-196c-5p，miRNA-1306-3，miRNA-411-3p，miRNA-126a-3p，miRNA-301a-3p，miRNA-339-5p,miRNA-186-5p，miRNA-192-5p，miRNA-582-5p，miRNA-200a-5p，miRNA-196a-5p，miRNA-345-5p，miRNA-140-5p，miRNA-872-3p，miRNA-7a-1-3p，miRNA-19b-3p，miRNA-466c-3p，miRNA-3584-5p，其中miRNA-196b-5p，miRNA-7d-3p，miRNA-126a-3p为高丰度miRNA（信号>500）。除去以上30多个变化有统计学意义的miRNAs之外，miRNA-21-5p、miRNA-30b-3p、miRNA-30b-5p、miRNA-140-3p等几个与DN发病关系比较密切的miRNAs在两组间也有变化趋势（p>0.10）。可见大鼠肾脏miRNA表达谱在AGEs的作用下发生了变化，并且几个经与DN发病关系比较密切的miRNA-21-5p、miRNA-192-5P也出现了变化。实验三靶基因的预测及验证本部分实验我们首先利用miRNA靶基因预测软件(Targetscan、PicTar、miRanda)预测miRNA-92b-3p的靶基因，确定目标研究基因为smad7，随后免疫组化、WesternBlot进一步验证实验动物不同组别肾组织靶基因smad7的表达。免疫组化结果显示，与RSA组及control组比较，AGEs组肾脏的肾小球中细胞核和细胞浆的Smad7的含量明显减少。Western结果显示与Control组比较RSA组肾小球Smad7表达无明显变化，而AGEs组Smad7表达灰度值明显减少，结果提示Smad7可能是miRNA-92b-3p的靶基因之一。结论：1给予AGEs的大鼠肾脏miRNAs表达谱发生变化，其中30多个miRNAs表达谱两组间存在差异。2给予AGEs的大鼠肾脏miR-92b-3p表达明显升高，Smad7蛋白表达降低。3Smad7可能是miRNA-92b-3p的靶基因之一。提示AGEs可能通过上调miR-92b-3p的表达进而抑制下游靶基因Smad7蛋白的表达，参与DN的发病过程。创新点：1首次从miRNAs的角度探讨AGEs在糖尿病肾病发病机制中的作用。2首次提出Smad7可能是miRNA-92b-3p的靶基因之一。
【作者】王丽萍；
【导师】于晓艳；
【作者基本信息】吉林大学，病理学与病理生理学，2014，硕士
【关键词】糖尿病肾病；糖基化终末产物；miRNA；Smad7；转生长因子；

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