PCR-RFLP法快速鉴定镰刀菌感染的真菌性角膜炎

【摘要】目的：从临床疑似真菌感染性角膜炎患者的角膜刮片中分离、提取DNA,建立一种临床常见真菌的基因聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法，进行实验研究以及临床应用。方法：根据医学真菌的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）基因片段合成了镰刀菌、青霉菌、拟青霉菌、白僵菌、红酵母等5种临床常见真菌的通用引物。取临床标本，分离真菌菌株，采用应用改良的GenTLETMDNA试剂盒提取方法方法提取DNA，用以上引物以及真菌通用引物ITS以及COI扩增基因组的ITS和COI的基因片段并测序，在GenBank核酸序列数据库进行同源序列搜索及分析，用限制性内切酶SspI及VspI酶切目的片段，行2.0%TAE琼脂糖凝胶电泳照相观察，分析比较酶切图谱，初步检测其特异性。结果：各菌株基因组DNA经ITS1、ITS4扩增后得到的片段长度约为550bp，产物分别回收进行核苷酸序列测定，并与GenBank中相应序列进行比对，以鉴定菌种。各菌株基因组DNA经COI-all1，COI－all2引物扩增后得到的目的片段长度在450bp左右。测序后进行酶切分析，用限制性内切酶SspI及VspI酶切目的片段，根据酶切图谱可以进一步将镰刀菌鉴定到种。结论：本研究中6种菌15株均可以用COI-all1，COI－all2引物扩增，得到450bp左右的片段。使用COI扩增的茄病镰刀菌，尖孢镰刀菌，串珠镰刀菌的PCR产物经VspI和SspI两种限制性内切酶酶切条带具有种内多态性，提示可以用于鉴别镰刀菌属的种间鉴定。限制性片段长度多态性分析方法可用于快速、简便地将镰刀菌鉴定到种，有很好的应用前景。
【作者】韩雪；
【导师】郝继龙；
【作者基本信息】吉林大学，临床医学，2014，硕士
【关键词】镰刀菌属；角膜炎；聚合酶链反应；限制性内切酶片段长度多态性；

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