P2Y_(12)受体自发激活及Gi和G12/13通路在血小板激活和血栓形成中的作用

【摘要】第一部分：P2Y12受体自发激活在血小板激活和血栓形成中的作用随着生活水平的提高,动脉血栓性疾病如冠心病和中风等已成为严重威胁我国人民健康的重要疾病。血小板异常激活引起的血管内血栓形成是这类疾病的病理基础,抗血小板药对于冠心病和中风的治疗效果是肯定的,但其治疗效果仍未尽如人意。目前临床上广泛应用的抗血小板药有环氧化酶抑制剂阿司匹林,P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、替卡雷洛(ticagrelor)和血小板纤维蛋白原受体拮抗剂等。阿司匹林是评价抗血栓药物疗效的金标准。虽然临床试验显示氯吡格雷总体疗效优于阿司匹林,但该药对于冠心病和中风的疗效不超过50%。而血小板纤维蛋白原受体拮抗剂抗血小板作用更强,但随之而来的出血等副作用也相应增加。所以,我们仍需要作用更强但副作用更小的抗血小板药物。作为血小板P2Y12受体拮抗剂,氯吡格雷对冠心病和中风病人的治疗效果毋庸置疑。但临床上部分病人的血小板对氯吡格雷无反应,即氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance),造成氯吡格雷部分临床治疗失败。我们认为尚未发现的血小板ADP受体P2Y12突变引起的P2Y12受体自发激活可能是部分病人氯吡格雷抵抗的原因。因为我们以往的研究发现,当ADP受体P2Y12的羧基端部分被相应的P2Y1受体取代(cP2Y12)并稳定表达在CHO-K1细胞时,能够表现出很强的自发激活活性并维持对激动剂的正常反应,利用此细胞系我们发现氯吡格雷是一个弱的P2Y12反向激动剂,这一特性决定了其对自发激活的血小板P2Y12受体仅有微弱的抑制作用,从而导致了临床治疗上的氯毗格雷抵抗。与此同时,利用此细胞系我们还发现了一种具有很强的反向激动剂活性的P2Y12受体拮抗剂AR-C78511。在本研究中,我们利用Tet-on系统建立了一种血小板特异性表达自发激活的cP2Y12受体的转基因小鼠。强力霉素可以特异性地在骨髓巨核细胞和血小板中诱导高水平的转基因cP2Y12的表达。转基因小鼠的血小板对2MeSADP、AYPGK、U46619(?)thrombin等血小板激活诱导剂诱导的聚集反应明显增强,表现出血小板的高反应性。转基因小鼠的静息态血小板内cAMP浓度降低,且可被AR-C78511逆转,证实了转基因小鼠血小板P2Y12受体的自发激活活性和AR-C78511的反向激动剂活性。转基因小鼠的出血时间缩短,氯化铁诱导的肠系膜动脉血栓形成更快、更稳定。这些结果提供了P2Y12受体自发激活易发血栓的直接证据,在血小板水平上进一步证实了AR-C78511的反向激动剂活性,支持AR-C78511作为新型抗血小板药用于血栓性疾病的预防、治疗具有治疗学优势。AR-C78511因其强反向激动剂活性应该具有比氯吡格雷更好的抗血小板、抗血栓作用,因此本研究为将AC-C78511研发为新型的抗血小板药奠定了基础。第二部分Gi和G12/13信号通路在血小板激活中的作用在多种生理和病理性刺激物的作用下,血小板能够被激活并发生粘附、变形、聚集、颗粒释放和血栓素A2合成等过程而最终导致生理性止血或病理性血栓形成。血小板激活在生理性止血和病理性血栓形成中起重要作用：血管损伤时血小板激活参与损伤修复反应,对于生理止血过程十分重要；血小板异常激活导致的动脉血栓形成导致的血管狭窄或闭塞,致使机体组织局部缺血或供血中断是冠心病、急性冠脉综合征、中风等动脉血栓性疾病的病理基础。经过几十年的基础研究和临床实践证明抑制血小板激活的抗血小板药对冠心病、中风的预防、治疗效果肯定,而研究血小板激活机制可以为研发抗血小板药物提供理论基础。G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors,GPCRs)是一大类膜蛋白受体的统称,具有七个跨膜结构区。研究显示G蛋白偶联受体能结合细胞周围环境中的多种化学物质从而激活细胞内的一系列信号通路,最终引起细胞状态的改变。凝血酶、TXA2、ADP、肾上腺素、SFLLRN、AYPGKF、胶原等都能直接或间接通过激活G蛋白偶联受体而激活血小板；和GPCR偶联、介导GPCR激活血小板的G蛋白有Gq、Gi和G12/13等。已有研究证实Gq和Gi信号通路或者Gq和G12/13信号通路同时激活时都能够引起血小板完全激活并发生聚集。虽然已有一些研究表明Gi和G12/13信号通路同时激活能够引起血小板GPⅡb/Ⅲa激活和血小板聚集,但这一理论是否正确仍存在争议。我们应用多种激动剂在小鼠、大鼠和人的血小板.上对此问题进行了研究,结果显示：当低浓度的血小板激动剂虽然可引起Gi和G12/13的同时激活,但并不能引起血小板激活和聚集,只有当激动剂浓度较高时血小板才发生聚集；当血小板激动剂浓度增加时,血小板内Akt和Erkl/2的磷酸化水平升高；PI3k抑制剂LY29402、Akt抑制剂SH-6和PKC抑制剂Ro31-8220能够显著抑制血小板聚集,因而PI3k/Akt/Erk和PKC通路在Gi和G12/13信号通路协同作用诱导的血小板聚集中起到重要作用；而Rho激酶抑制齐Y-27632、Src家族激酶抑制剂PP2及细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM对血小板聚集没有明显影响,且高浓度激动剂诱导Gi和G12/13通路激活时并未发现Ca2+动员,说明Gi和G12/13信号通路协同作用诱导的血小板聚集是Rho激酶、Src和Ca2+非依赖的。综上所述,本课题对Gi和G12/13信号通路在血小板激活中的作用进行了进一步的研究,并探讨了其可能的发生机制,为血小板激活和血栓形成提供了新的实验依据,并为研发新的抗血小板药物提供了实验和理论基础。
【作者】张艳；
【导师】丁忠仁；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2013，博士
【关键词】血小板；P2Y12；反向激动剂；转基因小鼠；ADP；Gi；G12/13；G蛋白；

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