银杏内酯B抑制血小板活化因子受体信号通路治疗卵巢癌相关机制

【摘要】卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,早期诊断困难,病理类型复杂多样,预后较差。虽经积极手术及术后化疗,五年生存率仍徘徊在40%左右。为了探寻卵巢癌治疗新靶点,我们在前期研究的基础上阐明了PAF/PAFR信号通路在卵巢癌侵袭中的作用及机制,观察了PAFR阻断剂银杏内酯B(GB)对裸鼠腹腔移植瘤的抑制作用,并初步探讨了GB降低携带BRCA1突变卵巢上皮细胞癌变风险的相关机制,研究分以下三部分：第一部分PAF促进卵巢癌细胞侵袭的相关机制目的探讨PAF对PAFR阳性卵巢癌细胞侵袭的影响及其相关机制。方法(1)以不同浓度的PAF处理OVCA429细胞6h后检测环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)蛋白的表达水平,处理24h后检测基质金属蛋白酶2(MMP2)蛋白的表达水平；以100nMPAF处理OVCA432,ES-2,SKOV3-luc及RMUG-L细胞各6h,检测p-CREB变化以100nmol/L的PAF处理OVCA429细胞不同时间后检测有丝分裂原活化蛋白激酶p38蛋白(p38MAPK).磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK).CREB及p-CREB蛋白的表达水平,上述各蛋白的表达水平均采用WesternBlot法检测。(2)在加入PAF(100nM)的基础上,分别加入各蛋白抑制剂,即PAFR抑制剂–GB(100μM)、p-p38MAPK抑制剂—SB203580(10μM)、CREB结合蛋白(CBP)-CREB相互作用抑制剂—217505(25gM)。实验分为6组：PAF组.PAF+GB组.PAF+SB203580组、PAF+217505组、PAF+SB203580+217505组及空白对照组,采用WesternBlot法检测各组细胞中p-p38MAPK、p-CREB、MMP2蛋白的表达强度。(3)Transwell法检测上述6组处理细胞的侵袭能力。结果(1)不同浓度的PAF处理后,OVCA429细胞中p-CREB、MMP2蛋白的表达水平呈明显的浓度依赖性(P<0.001),0.1nmol/L的PAF即可引起p-CREB,MMP2蛋白表达水平明显升高,至100nmol/L时达高峰；而CREB蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05)。在OVCA432、ES-2及SKOV3-luc中可见到类似结果,但在RMUG-L细胞中未检测到p-CREB的变化。在100nmol/L的PAF处理不同时间后,OVCA429细胞中p38MAPK,CREB蛋白表达水平与无明显变化(P>0.05)；而p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达水平明显升高趋势(P<0.001),至处理6h时达高峰,随后逐渐降低。(2)与空白对照组比较,PAF组细胞中p-p38MAPK、p-CREB及MMP-2蛋白的表达强度明显增强。与PAF组比较,PAF+GB组、PAF+SB203580组、PAF+SB203580+217505组细胞中p-p38MAPK、p-CREB及MMP-2蛋白的表达强度明显减弱,但PAF+SB203580+217505组与PAF+GB组及PAF+SB203580组相比无明显差异；PAF+217505组细胞中p-p38MAPK、p-CREB蛋白的表达强度无明显变化,但其MMP2蛋白的表达强度明显减弱。(3)Transwell实验结果提示,PAF组的穿膜细胞数最多,PAF+GB组穿膜细胞数明显减少,PAF+SB203580组细胞侵袭能力明显下降,但穿膜细胞数与空白对照相比仍有统计学意义,而PAF+217505组细胞的侵袭力显著下降,且抑制效果优于SB203580；而PAF+SB203580+217505组有更好的抑制PAF引起的侵袭效果,但仍弱于PAF+GB组。结论PAF促进PAFR阳性的卵巢浆液性癌细胞的侵袭这一作用可能是通过p38MAPK激活转录因子CREB,进一步上调MMP2蛋白的表达而实现的。抑制这一信号通路可减弱PAF所导致的细胞侵袭能力。第二部分银杏内酯B治疗卵巢癌体内实验研究目的构建裸鼠卵巢癌腹腔种植瘤模型,动态监测裸鼠血清PAF水平,并观察PAFR阻断剂GB在体内对肿瘤的抑制作用。方法以细胞免疫荧光检测携带荧光酶基因的SKOV3-luc细胞PAFR表达情况；腹腔注射SKOV3-luc细胞构建裸鼠卵巢癌腹腔种植瘤模型；动物活体成像监测腹腔内肿瘤的进展情况；分别在种植细胞前、成瘤后及治疗2周后经尾静脉采血100μl,制备血清,以ELISA试剂盒测定血清PAF浓度。腹腔注射SKOV3-luc细胞4周后,选取其中40只成瘤裸鼠,随机均分为4组,按以下方案治疗3周：阴性对照组(DMSO):DMSO100μl/d,GB治疗组：GB10mg/d,阳性对照组(CDDP):CDDP5mg/kg/w,GB+CDDP治疗组：GB10mg/d+CDDP5mg/kg/w,均为腹腔注射给药。自治疗开始每隔3天活体成像一次,根据荧光强度绘制各组肿瘤生长曲线。治疗结束后牺牲裸鼠,取肿瘤组织,称重,计算抑瘤率。免疫组化检测各组肿瘤组织中PAFR、Src、p-Src及CyclinD1蛋白的表达情况。结果免疫荧光结果显示,在SKOV3-luc细胞上有PAFR高表达；腹腔注射细胞后约4周,在裸鼠腹腔可探及弥漫分布的肿瘤组织；组织中可检测到PAFR高表达；各组裸鼠血清PAF浓度在腹腔注射癌细胞4周后明显升高(约6倍),经各组方案治疗2周,水平无明显改变；在各治疗组,自第6天起,GB及CDDP组肿瘤生长类似(P>0.05),均显著低于DMSO组(P<0.001),而GB+CDDP组肿瘤生长最慢,显著低于上述二组(P<0.001)；治疗第3周牺牲裸鼠,各组抑瘤率分别为：(JB:48%,CDDP:53.7%,GB+CDDP:78.2%；免疫组化结果显示,各组肿瘤组织中Src表达无明显差异,而p-Src在GB或GB+CDDP组的表达显著低于DMSO及CDDP组,CyclinD1在各组中的表达由弱到强依次是GB+CDDP、CDDP、GB及DMSO组。结论PAF在卵巢癌腹腔移植瘤裸鼠体内升高,PAFR阻断剂GB在体内可抑制肿瘤生长,与CDDP联合使用具有一定的协同作用,提示GB可作为临床卵巢癌患者化疗的辅助药物。第三部分银杏内酯B降低携BRCA1突变卵巢上皮细胞癌变风险相关研究目的利用抗体蛋白芯片的技术探讨GB是否有降低BRCA1突变者患卵巢癌的风险及相关机制。方法选择来源于BRCA1突变患者接受预防性卵巢切除标本所构建的卵巢上皮细胞株HOSE636.对细胞株行核型分析了解遗传学背景,并行外显子测序分析该细胞的BRCA1突变情况,WesternBlot检测突变BRCA1剪切蛋白的表达。HOSE636细胞以GB或DMSO持续处理7天,提取细胞总蛋白,选择肿瘤发生发展相关抗体蛋白芯片检测分析两组差异表达的蛋白,共重复实验两次,取蛋白改变倍数的平均值。以WesternBlot检测对部分差异蛋白进行验证。以PathwayStudio5.0软件进行蛋白网络构建,分析各差异蛋白在卵巢癌发生发展中的作用。结果核型分析提示HOSE636细胞为正常女性核型。外显子测序提示该细胞存在BRCA1第11号外显子196delA突变,WesternBlot检测到2条分子量大约25kDa的BRCA1蛋白剪切片段,而无正常BRCA1蛋白。经GB治疗7天后,抗体蛋白芯片结果检测到28个上调蛋白(升高1.5-15.5倍),22个下调蛋白(降低1.5-28.3倍)。初步分析显示,上调蛋白中的25个蛋白都具有对抗肿瘤作用,如P53蛋白,而所以的下调蛋白都与肿瘤的形成,发展及转移密切相关,如β-catenin蛋白等。PathwayStudio5.0软件分析发现其中45个差异蛋白可相互构成网络,显示了降低肿瘤的发生发展风险,包括下调细胞增殖相关网络(如PU.1、paxillin、β-catenin、PLCb1、DGKq等蛋白),上调肿瘤抑制相关网络(如P53蛋白),增强DNA损伤修复相关网络(如P53、XPA、SRPK1等蛋白)。结论我们的结果表明GB对携带BRCA1的卵巢上皮细胞具有降低癌变的风险,从分子生物学水平提示GB可用于这类女性卵巢癌的预防。其体内是否有相同的作用及更详细的机制有待于进一步研究。
【作者】姜伟；
【导师】徐丛剑；
【作者基本信息】复旦大学，妇产科学，2013，博士
【关键词】卵巢癌；血小板活化因子/受体；信号通路；侵袭；乳腺癌易感基因1；抗体蛋白芯片；

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