曲古菌素A调控Survivin干预神经胶质瘤凋亡的研究

【摘要】神经胶质瘤作为目前临床上的高发性脑部肿瘤，由于死亡率高，复发率高的特点，严重威胁着人类的健康。但是由于其发病部位的特殊性，常规的手术治疗被极大的限制，在治疗时得不到很好的效果。而目前常规的抗肿瘤药在治疗神经胶质瘤时，虽然可以对肿瘤细胞有一定的杀伤效果，但也对正常的神经组织和细胞产生较大的损伤，并且在预后过程中，神经胶质瘤细胞能够产生极强的耐药性，从而限制了常规的抗肿瘤药在神经胶质瘤治疗中的使用。因此，寻找治疗神经胶质瘤的新靶点以及开发治疗神经胶质瘤的新药物具有极大的临床参考价值和实用意义。Survivin作为目前已发现的最强抑制凋亡蛋白之一，可以通过直接抑制凋亡终端效应蛋白Caspase-3，达到抑制凋亡，促进增殖的作用，对肿瘤的发生发展有十分重要的意义。已有研究报道，Survivin在神经胶质瘤中有较高表达，与此同时在正常的神经组织和细胞中Survivin的表达较低。这种在肿瘤和正常组织中表达的特异性使其极有可能成为神经胶质瘤治疗领域的新靶点。但目前，对于神经胶质瘤中Survivin的调控机制尚不明确。曲古菌素A（TSA）作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的代表，可以通过抑制肿瘤细胞中过高表达的去乙酰化酶的活性，调节肿瘤中去乙酰化水平，调节相关基因的转录达到有效杀伤肿瘤细胞的作用。在抗肿瘤的同时，TSA还具有广谱、高效，低毒的特点。已有研究表明，TSA在有效杀伤肿瘤细胞的同时，对神经组织和细胞有一定的保护作用。TSA这种对肿瘤和正常组织凋亡调控的特异性可能与Survivin在肿瘤和正常组织中表达的特异性存在一定的相关性。实验目的：本实验拟研究TSA对神经胶质瘤细胞凋亡作用的影响，并进一步的探讨TSA通过调控Survivin介导神经胶质瘤凋亡的相关机制。实验方法：分别对PC12细胞系及C6细胞系进行培养，通过CCK-8实验检测TSA在不同剂量浓度下对PC12细胞及C6细胞存活率的影响，确定TSA是否对神经胶质瘤细胞杀伤的同时对正常神经细胞无损伤并确定TSA的最佳工作浓度；采用细胞形态学实验和流式细胞术，观察TSA给药前后，PC12细胞及C6细胞形态的变化以及凋亡率的变化，进一步确定TSA对PC12细胞及C6细胞凋亡的影响；HDACs活性试剂盒检测TSA给药前后，第Ⅰ类HDAC活性的变化；免疫荧光染色观察，在TSA给药前以及TSA给药后使第Ⅰ类HDAC活性发生变化时，PC12细胞及C6细胞中Survivin及被其直接抑制的Caspase-3表达的变化，研究TSA对神经胶质瘤细胞及正常神经细胞中Survivin表达的影响以及神经胶质瘤细胞细胞中第Ⅰ类HDAC活性与Survivin表达的关系；采用Westernblot法观察不同剂量TSA作用下，神经胶质瘤细胞及正常神经细胞中Survivin和Caspase-3的表达变化，通过上述指标来评价TSA对Survivin的调控作用以及TSA通过调控Survivin对神经胶质瘤细胞凋亡的介导作用。并选用丙戊酸钠为工具药，使用HDACs活性试剂盒和westernblot法进一步验证实验的结论。实验结果：1.CCK-8实验结果显示：与Control组相比较，C6细胞TSA100nM组存活率为：81.33%±4.15；200nM组的存活率为：65.33%±2.15；400nM组存活率为：37.14%±2.66。与Control组相比较，PC12细胞TSA100nM组、200nM组存活率无明显差异，在400nM时，存活率为84.67%±4.33。2.细胞形态学实验结果显示：与Control组比较，发现PC12的密度无明显变化，细胞形态也无明显改变；而C6细胞200nM给药组与Control组比较，细胞密度明显减少，细胞间距变大，细胞轮廓不清。3.流式细胞术实验结果表明：TSA在200nM浓度下，PC12细胞的凋亡率（5.42%±0.23）与Control组的凋亡率（3.37%±0.36）相比较，无明显差异。而在200nM浓度下C6细胞的凋亡有明显增加，其结果与毒性试验的结果相一致，200nM组凋亡率为：30.11%±1.97，Control组的凋亡率为3.12%±1.31，存在明显差异（P＜0.01）。4.第Ⅰ类HDAC活性检测实验结果表明：C6细胞的Control组中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8活性，与PC12细胞的Control组比较，均有显著性差异（P＜0.01），活性明显高于PC12细胞的Control组；而在C6细胞200nMTSA给药处理24h后，与C6细胞Control组相比较，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8的活性均有明显下降（P＜0.01），且下降的比例巨大。而PC12细胞200nM给药组与PC12细胞Control组比较，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8的活性无明显变化。5.免疫荧光染色结果显示：C6细胞Control组Survivin的荧光强度明显高于C6细胞给药组。而PC12细胞Control组Survivin的荧光强度与PC12细胞给药组无明显差别。同时，C6细胞Control组Survivin的荧光强度也明显高于PC12细胞Control组Survivin的荧光强度；而在TSA给药后，C6细胞中的Caspase-3活性的荧光强度明显高于C6细胞Control组。而PC12细胞Control组Caspase-3的荧光强度与PC12细胞给药组无明显差别。6.Westernblot实验结果显示：TSA给药剂量为100nM、200nM、400nM。Survivin在C6细胞中的表达随着TSA剂量的增加，呈现逐步下降的趋势，而PC12细胞中的Survivin无明显变化；C6细胞中Caspase-3的表达随着TSA剂量的增加而增加，在100nM和200nM给药时，PC12细胞中的Caspase-3与PC12细胞Control组比较无明显差异，在400nM剂量时有明显上升（P＜0.01）。7.在验证性实验中，选用丙戊酸钠为工具药，采用HDAC活性检测实验和Westernblot实验，实验结果显示与TSA的相关实验结果基本一致。实验结论：1.在一定剂量范围内，TSA可以有效杀伤神经胶质瘤细胞而对正常神经细胞无损伤；2.神经胶质瘤中第Ⅰ类HDACs的活性明显高于正常神经细胞，TSA可以有效降低神经胶质瘤细胞第Ⅰ类HDACs的活性；3.神经胶质瘤中Survivin的表达明显高于正常神经细胞，抑制Survivin蛋白水平的表达是TSA杀伤神经胶质瘤细胞的机制之一；4.TSA可能通过降低神经胶质瘤中第Ⅰ类HDACs的活性，改变神经胶质瘤中组蛋白去乙酰化的水平，调控Survivin的表达，进而促进Caspase-3的活性增加，达到促进神经胶质瘤细胞凋亡的作用。
【作者】王韡；
【导师】陈霞；
【作者基本信息】吉林大学，药理学，2014，硕士
【关键词】神经胶质瘤；曲古菌素A；Survivin；组蛋白去乙酰化酶；凋亡；

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