栀子苷对LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤保护效果的研究

【摘要】本论文选取栀子苷这种中药成分，研究其对构建的BALB/C小鼠乳腺炎性损伤模型的保护性效果。通过体内试验，以脂多糖（LPS）刺激构建小鼠乳腺炎性损伤模型，研究栀子苷对LPS诱发的体内小鼠乳腺炎损伤的保护性作用；同时，体外分离培养小鼠乳腺上皮细胞，研究栀子苷对LPS诱发的小鼠乳腺上皮细胞炎性损伤的保护性作用，并探讨其在NF-κB信号通路中的作用机制。本研究为传统中药天然成分用于奶牛乳腺炎防治提供理论依据。首先，本实验通过乳头导管灌注LPS构建小鼠乳腺炎模型。将产仔5天的雌鼠随机分为6组：正常组、LPS组、栀子苷低剂量组（25mg/kg）、栀子苷中剂量组（50mg/kg）、栀子苷高剂量组（100mg/kg）、地塞米松组（5mg/kg），每组6只，并按实验分组进行LPS刺激和栀子苷、地塞米松给药处理。处死解剖小鼠，观察其乳腺组织，制作病理组织切片和免疫组织化学切片，观察其病理变化和组织中MPO活性的变化；用ELISA方法检测各组乳腺组织内TNF-α，IL-6和IL-1β细胞因子的表达水平。结果表明：与正常组相比，LPS刺激组乳腺组织有红、肿等炎性变化，表明模型建立成功；HE和免疫组织化学实验表明，栀子苷显著地减轻LPS诱导的乳腺炎症状，并呈剂量相关性；ELISA检测结果表明，栀子苷可以显著地抑制LPS诱导的乳腺组织内TNF-α、IL-6和IL-1β细胞因子的表达，并呈剂量相关性。其次，分离培养小鼠乳腺上皮细胞，通过形态学和生物学方法鉴定，构建小鼠乳腺上皮细胞炎性损伤模型。通过MTT试验评价栀子苷对小鼠乳腺细胞的毒性；培养的细胞随机分5组：正常组、LPS组、栀子苷低剂量组（50mg/kg）、栀子苷中剂量组（100mg/kg）、栀子苷高剂量组（200mg/kg），按实验分组给予LPS刺激和栀子苷给药处理，ELISA方法检测各组乳腺上皮细胞中TNF-α，IL-6和IL-1β细胞因子的表达水平；RT-PCR方法检测各组中TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达水平。结果表明乳腺上皮细胞分离培养成功，细胞纯度符合试验要求；所选取50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL浓度的栀子苷对小鼠乳腺上皮细胞无毒性作用；栀子苷抑制LPS刺激的小鼠乳腺上皮细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β细胞因子的表达，与其mRNA的表达结果一致，并呈剂量相关性。最后，以4×105/mL密度，每孔2mL的小鼠乳腺上皮细胞，接种于6孔细胞培养板，实验设正常组、LPS组、栀子苷低剂量组（50mg/kg）、栀子苷中剂量组（100mg/kg）、栀子苷高剂量组（200mg/kg），按分组给予LPS刺激和栀子苷给药处理，随后收集蛋白进行Westernblot实验。实验结果表明：LPS刺激的小鼠乳腺上皮细胞可以显著地引发NF-κBp65和IκB的磷酸化；栀子苷在50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL浓度时可以通过抑制LPS导致的NF-κBp65和IκB的磷酸化水平的升高进而抑制NF-κB信号转导通路激活，并且随栀子苷浓度的升高，抑制作用加强。以上实验表明栀子苷能够对LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤起到良好的保护效果，证实栀子苷抗炎作用机制是通过抑制NF-κB信号通路的激活，来降低TNF-α、IL-6和IL-1β细胞因子的表达，进而减轻乳腺组织的炎性损伤。
【作者】孙勇；
【导师】张乃生；
【作者基本信息】吉林大学，临床兽医学，2014，硕士
【关键词】乳腺炎；LPS；栀子苷；小鼠乳腺上皮细胞；NF-κB；

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