犬瘟热病毒抗体液相芯片检测方法的建立及评价

【摘要】实验犬是目前教学和科学研究工作中最广泛应用的动物之一，每年有大量的实验犬用于药物安全性评价和体外循环研究等试验。质量控制是目前实验犬标准化过程中面临的一大难题。我国国家标准GB14922.2-2011《实验动物微生物学等级及监测》中规定犬瘟热病毒为实验犬必检项目。而且无特定病原体实验犬不能免疫接种犬瘟热疫苗，必须为犬瘟热病毒抗体阴性。目前，能够检测犬血清抗体水平的技术主要有免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验等方法。这些方法有一个共同的缺点：一次试验只能检测一种病原抗体水平，无法实现对多种病原抗体的实时监测。液相芯片是一种新型生物芯片技术平台，具有操作简便、敏感性强、灵活多变、检测范围广等显著特点，其最大的优势是可以同时对同一血清样品中多种病原抗体进行定性分析，实现多种病原抗体的实时监测。本研究利用小鼠IgG与荧光微球D6偶联，通过偶联验证试验，评估偶联效率，优化偶联过程的主要影响因素。最终确定偶联过程中：二硫苏糖醇（1M，DTT）使用量为2μL，反应时间为1h；4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧基磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（2mg/L，sulfo-SMCC）使用量为2μL，反应时间为1h；蛋白质-sulfo-SMCC复合物与活化荧光微球反应时间为1h，N-乙基马来酰亚胺（2mg/mL,NEM）用量为2μL，反应时间为20min。本研究对犬瘟热病毒N蛋白氨基酸序列的B细胞抗原表位预测并人工合成，预测结果包含8条氨基酸序列。采用差速离心法纯化犬瘟热病毒制备全病毒液。犬瘟热病毒重组H蛋白由真核细胞表达，购自美国ImmuneTech公司。将N蛋白B细胞抗原表位合成多肽、全病毒液和重组H蛋白分别与荧光微球D6偶联制备捕获微球，检测犬瘟热病毒阳性血清和阴性血清，检测结果表明：犬瘟热病毒重组H蛋白制备的捕获微球可用于犬瘟热病毒抗体液相芯片的建立。对液相芯片检测过程中的影响条件进行了优化，优化结果为：捕获微球用量为1μL，PBS（0.01M，pH7.2）稀释至50μL；捕获微球与待检血清的反应时间为1h；PE标记羊抗犬抗体的稀释倍数为1:8，反应时间为1h。对犬瘟热病毒抗体液相芯片检测方法进行了评价，评价结果为：犬瘟热病毒抗体液相芯片与狂犬病毒阳性血清、犬细小病毒阳性血清及犬2型腺病毒阳性血清均无交叉反应；抗体效价最低检测限为1:6800；组内CV值均小于5%，组间CV值为2.98%；4℃环境下可以稳定保存90天，室温环境下可以稳定保存7天；与ELISA试剂盒检测结果的符合率为90%，配对X2检验，P<0.01。本研究建立的犬瘟热病毒抗体液相芯片检测方法特异性强，敏感性强，重复性和稳定性好，可作为ELISA试验的替代技术，为下一步构建犬主要病毒病抗体液相芯片监测体系奠定了基础。
【作者】张海雷；
【导师】靳朝；
【作者基本信息】吉林大学，临床兽医学，2014，硕士
【关键词】犬瘟热病毒；抗体；液相芯片；荧光微球偶联；

【参考文献】
[1]陆杨.基于磁性组装的纳米复合造影剂[D].中国科学技术大学,2011.
[2]蒋凌燕,查英华.基于HTML5的响应式Web页面重组适配技术研究[J].计算机与现代化,2015,02:7.
[3]曹姣洁.聚倍半硅氧烷空心/碗状颗粒的制备及在药物缓释领域的应用[D].山东大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[4]杨莹.婚姻家庭中女性人身权益的法律保护[D].华东交通大学,民商法,2014,硕士.
[5]佘卉囡.梦窗词在清代词学中的接受与经典化[D].江南大学,中国古代文学,2013,硕士.
[6]王瑶瑶.系统性硬皮病CD4~+T细胞表观遗传学修饰异常的研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[7]本报见习记者王志国.先丰纳米,专注新材料应用的先锋[N].中国建材报,2013-04-11002.
[8]徐凤.硫化亚铜和氧化锌复合薄膜的制备与特性研究[D].吉林大学,光学,2014,硕士.
[9]许松华.危险货物运输监控系统关键技术研究[D].北京交通大学,2007.
[10]邓钰栋.模糊推理在绝缘子污秽监测中的应用[D].西安理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[11]吴永平.公共环境与陶瓷雕塑[D].中央美术学院,美术学,2004,硕士.
[12]满珊珊.广东省职业教育集团化办学的问题和对策研究[D].广东技术师范学院,职业技术教育学,2014,硕士.
[13]孙平.我国高等教育模式的研究[D].辽宁工程技术大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[14]杨晓伟.中国居民家庭收入流动性测度研究[D].华中科技大学,西方经济学,2012,硕士.
[15]冉建斌,张明玉,徐常胜,黄小平,康南昌,罗文山,邢红阁,李杰.地震资料处理解释一体化的质量监控技术研究[J].石油地球物理勘探,2010,04:545-551+624+468.
[16]段小华.花生黄曲霉抗性研究[D].华南师范大学,植物学,2004,硕士.
[17]姚振一.闽楠幼树光合特性研究[D].中南林业科技大学,林业,2013,硕士.
[18]孙广义.小兴安岭伊春一带地球化学特征及找矿预测[D].东北石油大学,地质工程（专业学位）,2013,硕士.
[19]朱绍华.A Descriptive Study on the Translation of Plant Terms in Shi Jing[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[20]孙焱.腰交感神经节射频热凝术的解剖学基础[D].山西医科大学,人体解剖学与组织胚胎学,2013,硕士.
[21]张雪彩.一类变系数KdV和mKdV方程的李群数值解法[D].兰州大学,计算数学,2013,硕士.
[22]李学恭.深海超嗜热嗜压古菌Pyrococcus yayanosii压力适应性机制研究[D].中国海洋大学,微生物学,2014,博士.
[23]杨美玲.一种便携式无线血糖计步仪的研究与开发[D].吉林大学,精密仪器及机械,2013,硕士.
[24]郝爱萍.新课程下高一物理学困生转化策略[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[25]余四龙.太阳能电池封装用EVA胶膜交联动力学及封装性能研究[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[26]赵时旻,蔡昊,杨建国.地铁车站空气品质的评价与探讨[J].城市轨道交通研究.2007(11)
[27]林子雄.基于流程模拟器与列队竞争算法的精馏过程优化[D].武汉理工大学,化学工程,2012,硕士.
[28]顾佳.海南昌江杞黎的丧葬与祭祀[D].广东技术师范学院,民族学,2014,硕士.
[29]文峰.人脐带间充质干细胞在与Hep3B肝癌细胞共培养条件下的分化及对Hep3B增殖影响[D].泸州医学院,肿瘤学,2012,硕士.
[30]李增.关于日本岛国根性的考察[D].上海外国语大学,日语语言文学,2012,硕士.
[31]耿迎涛.基于仿射模型的中国国债市场利率期限结构动态检验[D].吉林大学,金融学,2014,硕士.
[32]刘春艳.嫩江下游二龙涛灌区地下水总量控制管理研究[D].黑龙江大学,水利工程,2013,硕士.
[33]李向波.欧盟保障措施法研究[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[34]陶树平,屠颖.关联规则和分类规则挖掘算法的改进与实现[J].计算机工程,2003,15:100-101+187.
[35]雒兴刚,汪定伟,唐加福.基于质量功能展开的产品配置模型[J].控制与决策,2006,12:1360-1364.
[36]周智芝.新城疫病毒诱导人耐顺铂A549肺癌细胞凋亡的研究[D].扬州大学,细胞生物学,2012,硕士.
[37]孙怡.基于广义加—乘危险率模型的成本节约型试验研究[D].复旦大学,概率论与数理统计,2012,硕士.
[38]赵魏丹.优势视角下社会工作对提升青少年抗逆力的介入研究[D].华中科技大学,社会工作,2013,硕士.
[39]师慧敏.解脂酵母中POX3基因的敲除研究[D].天津科技大学,生物化学与分子生物学,2010,硕士.
[40]朱元保.社会保障政府财政责任研究[D].江西财经大学,社会保障,2013,硕士.
[41]王祖华.小麦蛋白激酶基因的克隆及小麦白粉病新抗源的遗传分析[D].河南农业大学,作物栽培学与耕作学,2004,硕士.
[42]沈飞.我国土地征用的制度性寻租问题研究[D].中国农业大学,土地资源管理,2004,硕士.
[43]迟国泰,许文,王化增.兼控利率风险和流动性风险的资产负债组合优化模型[J].控制与决策,2006,12:1407-1411+1416.
[44]唐皎.我国增值税会计问题研究[D].长安大学,会计学,2013,硕士.
[45]MuhammadImranAmirzada.重组人白介素24在大肠杆菌中的高效表达及其抗肿瘤应用[D].江南大学,发酵工程,2014,博士.
[46]康喜来.世居高原田径径赛运动员高原训练与平原比赛身体机能变化的实验研究[D].陕西师范大学,2005.
[47]吴菊英.日韩留学生转折连词习得偏误分析[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[48]陈兴汉.宝石抛光技术的发展及影响抛光效果和速度的主要因素探讨[J].江西地质科技.1997(04)
[49]张国力.基于模糊综合评价的国有大型企业信息安全管理研究[D].北京邮电大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[50]卢海.基于PMOGA和可视化技术的多目标优化方法研究[D].武汉理工大学,化学工程,2012,硕士.