内质网应激—自噬反应减轻NRK-52E细胞过蛋白负荷损伤

【摘要】各种以蛋白尿为主要表现的肾病的病理和病理生理的发展是一个复杂且缓慢的过程，最后变化均表现为肾小球硬化症或肾小管间质纤维化，然而近年来的研究表明小管间质病变与肾损伤有更为紧密的关系。已有研究证实蛋白尿水平和慢性肾衰的进展密切相关。大量动物实验和临床研究发现过蛋白负荷直接导致肾小管间质受损，但是其机制尚未完全阐明，对蛋白尿导致的肾小管间质损伤也没有有效的治疗手段。为了研究尿蛋白对肾小管上皮细胞（NRK-52E）损伤的作用机制，提出以下推测：胞内蛋白蓄积，引起内质网应激；同时，蓄积蛋白拥塞溶酶体降解通路，抑制自噬反应，因内质网应激与自噬的关联性，未折叠蛋白反应加剧，导致细胞损伤甚至死亡。因此，设计以下思路：实验目的：本研究通过阿霉素（adriamycin，ADM）和去脂无内毒素白蛋白（BovineSerumAlbumin，BSA）致NRK-52E细胞过蛋白负荷来模拟体内蛋白尿环境，研究过蛋白负荷致肾小管上皮细胞凋亡的机制，并利用自噬抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）来抑制自噬的终末阶段，观察肾小管上皮细胞的凋亡情况，为进行性肾脏损伤治疗靶点的研究奠定理论基础。实验方法：1.MTT法检测ADM、BSA及联合CQ对NRK-52E细胞存活率的影响；2.倒置显微镜观察细胞形态变化；3.AnnexinV/propidiumiodide双染后，流式细胞仪检测NRK-52E细胞凋亡；4.westernblot法检测GRP78、CHOP、LC3、Beclin1和p-PERK的表达情况。实验结果：MTT结果显示ADM和BSA引起NRK-52E细胞损伤呈时间和剂量依赖性；倒置显微镜下观察细胞发生凋亡时，细胞变圆，细胞间隙增加；流式细胞术显示ADM、BSA及联合CQ能够显著增加NRK-52E细胞凋亡；westernblot结果显示ADM+BSA组GRP78、CHOP及LC3的表达高于对照组及单独ADM、BSA组，Beclin1的相对表达量降低；CQ抑制自噬后内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP及凋亡因子p-PERK表达增高。实验结论：1.阿霉素及去脂无内毒素BSA致NRK-52E细胞发生的过蛋白负荷导致细胞内质网应激，继而诱导细胞凋亡。2.抑制自噬导致内质网应激增强，明显增加过蛋白负荷对肾小管上皮细胞的损伤，可以为治疗蛋白尿造成肾小管损伤寻找有效靶点提供理论依据。
【作者】王芳；
【导师】杨成君；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】内质网应激；自噬；蛋白尿；细胞损伤；凋亡；

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