shRNA沉默HDAC1基因增强卵巢癌耐受顺铂细胞SKOV3/DDP对顺铂的敏感性

【摘要】
【作者】公培刚；
【导师】张家颖；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【背景】肿瘤细胞的多药耐药（MDR）是临床上癌症化疗失败的主要因素之一。MDR的分子机制非常复杂，主要有由P-糖蛋白（MDR1/P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和肺耐药相关蛋白（LRP）等转运蛋白介导的MDR，由谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、拓扑异构酶II（TopoII）和蛋白激酶C（PKC）等酶类介导的MDR，和由凋亡相关基因介导的MDR。HDAC1是一种组蛋白去乙酰化酶，能够催化组蛋白去乙酰化，在染色体的结构修饰和基因的表达调控方面发挥着重要作用。它与肿瘤的发生密切相关，在多数肿瘤细胞中高表达；研究表明HDAC1在卵巢癌耐受顺铂细胞（SKOV3/DDP）中也呈现高表达。HDAC1是否参与了卵巢癌的MDR，沉默HDAC1基因能否增强SKOV3/DDP细胞对DDP的敏感性，能否改变MDR1、Bcl-2及Bax这些MDR有关基因的表达，我们带着这些问题进行了本课题研究。本实验分三部分，目的、方法及结果分别如下：第一部分SKOV3/DDP细胞株耐药性的检测
【目的】鉴定SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐受性，判断能否以该细胞为卵巢癌耐药细胞模型进行肿瘤耐药逆转方面的研究。
【方法】光镜下观察SKOV3细胞（DDP敏感株）和SKOV3/DDP细胞（DDP耐受株）的细胞形态差异，观察不同浓度的DDP对SKOV3细胞及SKOV3/DDP细胞生长的影响；MTT法检测不同浓度的DDP对两细胞生长的增殖抑制率，计算SKOV3/DDP细胞的耐药指数。
【结果】SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞的形态学差异明显，对DDP具有不同的耐受性，SKOV3/DDP细胞耐受DDP的耐药指数为3.15。确立了以SKOV3/DDP细胞为卵巢癌耐药细胞模型进行肿瘤耐药逆转方面的研究；第二部分shRNAHDAC1重组质粒干扰效率的鉴定
【目的】鉴定公司合成后的重组质粒，筛选出对SKOV3/DDP细胞中HDAC1基因干扰效率较高的质粒用于后续实验。
【方法】选择两段干扰HDAC1mRNA的靶序列，委托公司合成重组质粒，分别命名为重组质粒shRNAHDAC1-1和shRNAHDAC1-2，同时设立阴性对照质粒shRNAcontrol；对重组质粒进行酶切及测序鉴定；将重组质粒利用脂质体转染法导入SKOV3/DDP细胞中，提取总RNA进行RT-PCR检测各组HDAC1mRNA的表达量。
【结果】重组质粒酶切及测序鉴定结果符合设计要求；转染质粒shRNAHDAC1-2后SKOV3/DDP细胞中HDAC1mRNA相对表达量为（0.32±0.09），较转染质粒shRNAHDAC1-1后表达水平（0.45±0.39）低（P＜0.05）；确立了以干扰效率较高的shRNAHDAC1-2质粒用于沉默HDAC1的实验研究。第三部分shRNA重组质粒沉默HDAC1对SKOV3/DDP细胞的影响
【目的】检测shRNA重组质粒沉默HDAC1对SKOV3/DDP细胞的影响
【方法】SKOV3/DDP细胞转染重组质粒后，Real-timePCR法检测耐药有关基因MDR1、Bcl-2和BaxmRNA的表达水平；流式细胞术检测对细胞凋亡的影响；MTT法检测SKOV3/DDP细胞对DDP敏感性的改变。
【结果】SKOV3/DDP细胞转染重组质粒后，MDR1mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2mRNA表达水平较正常组（P＜0.05）和阴性质粒对照组（P＜0.01）均降低，BaxmRNA表达水平没有显著变化（P＞0.05）；凋亡细胞和坏死细胞增多；且增强了对DDP的敏感性，细胞耐药指数降至2.04。
【结论】1、shRNA沉默HDAC1基因后增强了SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性，可能与耐药相关基因MDR1mRNA水平降低相关，提示HDAC1可能是逆转卵巢癌多药耐药的重要靶点；2、shRNA沉默HDAC1基因后诱导SKOV3/DDP细胞发生凋亡，可能与凋亡抑制基因Bcl-2mRNA水平降低相关。
【关键词】卵巢癌；顺铂；肿瘤多药耐药；RNA；干扰；HDAC1；

【参考文献】
[1]王玮.模拟/数字混合滤波器组设计算法研究[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2014,博士.
[2]王琳松,龙雨.水钢2号高炉炉底钻孔安装水冷管实践[J].炼铁.2000(03)
[3]杨丹.基于MTS理论的多团队学习和过程绩效的关系研究[D].浙江工商大学,企业管理,2014,硕士.
[4]张海波,蒋良敏,陶文伟,郭子健,张鹏飞.实用化分布式动态潮流计算系统的设计与实现[J].电力系统自动化,2012,09:67-71+76.
[5]王霞.电信决策支持系统浅析[J].电信科学,2002,06:28-31.
[6]孙吉贵,张居阳,陈尚伟.多元约束混合搜索算法研究[J].自动化学报,2007,09:974-978.
[7]廖云龙,王治章.锁相控制技术在中功率直流传动系统中的应用[J].自动化学报,1988,05:387-391.
[8]张欣.碳基材料表面复合涂层及性能研究[D].东北大学,材料学,2010,硕士.
[9]陈华星.数字法庭系统的设计与实现[D].浙江工业大学,2010.
[10]陈红.核阀流体动力学及流固耦合有限元分析[D].大连理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[11]张仲懿.应用于UHF RFID自动测试系统的读写器数字基带的设计[D].复旦大学,集成电路工程,2012,硕士.
[12]宋亚楠.Retextualizing Scenic Spots in the Context of C-e Translation[D].西安外国语大学,MTI翻译,2014,硕士.
[13]王爱萍.白介素8（IL8）及亚型与卵巢上皮性癌相关性研究[D].广西医科大学,肿瘤学（专业学位）,2013,硕士.
[14]张明.环境激素双酚A对SD大鼠睾丸生精细胞凋亡作用的实验研究[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[15]梁帅.基于粘滑驱动的精密定位台建模与控制[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2014,硕士.
[16]同济大学经济与管理学院副教授刘强.苏锡常制造业有许多可学之处[N].东方早报,2014-01-07007.
[17]于大洋.可再生能源发电并网协调策略的研究[D].山东大学,2010.
[18]邓智勇.波纹喇叭差模耦合技术的研究[D].西安电子科技大学,电磁场与微波技术,2011,硕士.
[19]郑炳坤.体位干预对早产儿胃食管反流和胃肠功能影响的研究[D].吉林大学,护理学,2014,硕士.
[20]姜明君.装备制造业集群知识管理模式研究[D].哈尔滨理工大学,系统工程,2012,硕士.
[21]耿莹.视觉深度信息提取方法研究[D].长春工业大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[22]王越.古典园林材料解析在现代室内景观中的运用[D].西南交通大学,艺术设计,2014,硕士.
[23]陈建宏,赵拥军,赖涛,黄洁.高分辨TerraSAR-X图像舰船目标几何参数提取方法[J].控制与决策,2015,06:1135-1138.
[24]余世明,杜维.目标规划法在预测控制滚动优化及在线辨识中的应用[J].自动化学报,2002,06:995-1000.
[25]刘善增,余跃庆,佀国宁,杨建新,苏丽颖.3自由度并联机器人的运动学与动力学分析[J].机械工程学报,2009,08:11-17.
[26]赵杰.河北省绿色物流金融发展研究[D].河北大学,金融学,2013,硕士.
[27]刘康平.MPEGⅡ压缩标准及其在DVD/DVB视频信号处理中的应用[D].西北工业大学,电路与系统,2004,硕士.
[28]周峥.MicroRNA-122和MicroRNA-146a的SNPs与肝癌易感性和切除术后近期复发的关系[D].南方医科大学,临床医学,2014,博士.
[29]野菊苹.数字化科普资源分类体系和元数据交换研究[D].华中师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[30]崔微微.城市商业银行组织结构变革研究[D].首都经济贸易大学,企业管理,2013,硕士.
[31]王金健.先进制造业一线员工素质提升体系构建研究[D].北京交通大学,2013.
[32]单鹏翼.益气养阴活血方对糖尿病大鼠大血管内皮素-1表达的影响[D].河北医科大学,中医内科学,2013,硕士.
[33]张孝顺,余涛,唐捷.基于分层相关均衡强化学习的CPS指令优化分配算法[J].电力系统自动化,2015,08:80-86.
[34]谢章明.人CYP3A4与POR及cyt b_5共表达条件的优化以及表达产物在药物相互作用研究中的应用[D].浙江大学,药学,2013,硕士.
[35]汤琪.《内经》地域养生思想探讨及恩施道地中药材对模式生物四膜虫的抗氧化作用研究[D].湖北中医药大学,中医基础理论,2013,硕士.
[36]齐瑾.新疆移动第二枢纽楼通信规划项目管理研究[D].南京邮电大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[37]孙建凯.数据挖掘中半监督K均值聚类算法的研究[D].浙江理工大学,基础数学,2013,硕士.
[38]骈江.昆明煤气集团主业重组后的发展战略研究[D].云南大学,工商管理,2012,硕士.
[39]高赞.石墨烯复合材料用于超级电容器电极材料的性能研究[D].哈尔滨工程大学,2012.
[40]金梁.我国车险电销发展瓶颈及突破转型研究[D].浙江工商大学,保险（专业学位）,2014,硕士.
[41]刘国强.功能性含氟聚合物微球的制备及性能研究[D].湖北大学,材料学,2012,硕士.
[42]李敏捷.基于PID算法的电液比例同步控制系统的研究及应用[D].重庆大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[43]郭惠琳.马来西亚陷入“中等收入陷阱”的原因分析和政策应对[D].厦门大学,世界经济,2013,硕士.
[44]牛宝林,陈汪林,刘书媛,张世宏.氮气分压对A1CrTiSiN涂层微观结构及力学性能的影响[J].中国表面工程,2015,02:1.
[45]宁谦.信托财产基本法律制度问题研究[D].苏州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[46]邢瀚.商业银行中型企业信用评级研究[D].东北财经大学,金融学,2012,硕士.
[47]周修宇.发展管理型会计软件中的几个问题[J].工业技术经济,2002,06:128-134.
[48]赵贝贝.被动结构的跨语言启动影响因素探究[D].山西师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[49]杨婷婷.沈阳市普通高校啦啦操开展现状的调查与分析[D].辽宁师范大学,体育教育训练学,2011,硕士.
[50]李晓杰.食品微生物自动检测系统的光学显微镜自动调焦技术研究[D].吉林大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.