表达H5N1高致病性禽流感血凝素蛋白（HA）的新型重组杆状病毒载体疫苗在小鼠中诱导免疫应答的初步研究

【摘要】杆状病毒Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus(AcMNPV)可以高效转导多种物种和器官来源的哺乳动物细胞。因为具有遗传背景清楚,生理生化科研积累丰厚,生物安全性好,能承载较大外源基因,表达外源蛋白效率高,可对表达的蛋白进行糖基化修饰,以保证外源基因产物具备生物学活性,容易扩大规模达到生产要求,无细胞毒性等优势使杆状病毒成为一个倍受关注的新型哺乳动物细胞基因转导载体。近来,杆状病毒表面展示系统的进步和穿梭启动子系统在昆虫细胞/哺乳动物细胞中的广泛应用,特别是07年以来,研究证实重组杆状病毒载体可以通过直接注射的方式转导哺乳动物细胞,并在小鼠模型中诱导有效的免疫反应,使重组杆状病毒作为新一代疫苗载体的研究展现出卓越的优势,并引起广泛关注。禽流感是由A型禽流感病毒中有致病性的任何一种血清亚型毒株引起各种家禽及野生禽类感染并发生全身性或呼吸器官综合征的一类烈性传染病。最近的研究逐渐证实：禽流感病毒可以直接或间接传染给人类,并引起严重的病态和很高的死亡率(62%),因此引起医学界的广泛关注。面对迫在眉睫的潜在危机,世界卫生组织着重强调：急需有效而安全的流感疫苗。血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)是决定禽流感病毒宿主范围、致病性强弱和免疫原性的重要因素,对研究、认识禽流感病毒有重要意义,是当前研究的重点和热点。本研究首先通过分子流行病学和生物信息学分析,确定了A/Vietnam/1203/2004(Viet04)株H5N1型高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白为典型代表,优化了血凝素蛋白基因编码序列,使其更适合在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达,并通过重叠延伸PCR技术人工合成了HA基因全长(1707bp)。然后,成功构建了能在病毒囊膜上展示HA蛋白的重组杆状病毒vAc-HA,矛口既胄邑展示HA蛋白又能在哺乳动物细胞中内源性表达HA蛋白的重组杆状病毒vAc-HA-DUAL.实验证明：vAc-HA和vAc-HA-DUAL两株重组杆状病毒均能在昆虫细胞(sf9)中正确表达HA蛋白。vAc-HA-DUAL还能在哺乳动物细胞(BHK和MDCK)内正确表达HA蛋白。同时,在哺乳动物细胞中,全长HA蛋白能被蛋白酶正确切割为HA1和HA2。HA蛋白能展示在重组杆状病毒的囊膜上,并且不影响重组杆状病毒的生产和应用。展示在重组杆状病毒表面的HA蛋白具有凝集红细胞的能力,并且能提高病毒进入部分哺乳动物细胞的效率,表明其具有生物学功能。本研究进一步在实验动物水平研究重组杆状病毒做为新型疫苗载体的功效。使用1×109pfu/只/次的剂量,通过直接注射免疫小鼠,共两次。初次免疫21天后,检测小鼠血清中总IgG抗体、总IgA抗体,HA特异性抗体的分泌水平,以及淋巴细胞经HA抗原再刺激之后,分泌IFN-γ、IL-4、IL-2、IL-6等细胞因子的能力,结果显示：相对vAc-GFP和PBS组对照,重组杆状病毒vAc-HA和vAc-HA-DUAL均能在小鼠模型中有效诱导机体产生显著体液免疫应答和细胞免疫应答,而且都具有良好的专一性。特别值得注意的是：重组杆状病毒vAc-HA诱导机体产生更偏向Th2途径的体液免疫应答,而vAc-HA-DUAL能诱导肌体产生更偏向Th1途经的细胞免疫应答,这是因为vAc-HA只在病毒颗粒表面展示HA抗原,具有蛋白疫苗的作用,而vAc-HA-DUAL除表面展示了HA抗原外,还能在病毒侵入细胞后在细胞中内源性表达HA抗原并递呈给免疫系统,从而发挥了蛋白疫苗和DNA疫苗的双重功效。综上所述,我们的研究结果证实：不同构造的重组杆状病毒作为抗原,可以在小鼠模型中诱导偏向Th1途经的细胞免疫应答或偏向Th2途经的体液免疫应答。重组杆状病毒不但可以通过表面展示递呈抗原,还能通过内源表达的方式发挥DNA疫苗的功效。为新型流感疫苗的研发提供了很有潜力的新途径和两种可以选择的策略。
【作者】胡志鹏；
【导师】钟江；
【作者基本信息】复旦大学，微生物学，2009，博士
【关键词】重组杆状病毒；H5N1型高致病性禽流感病毒；血凝素(HA)；体液免疫应答；细胞免疫应答；

【参考文献】
[1]房大中,孙景强.基于最优控制原理的暂态稳定预防控制模型[J].电力系统自动化,2005,01:18-21.
[2]陈凯亮.燃气蒸汽联合循环发电机组故障诊断方法研究及应用[D].浙江大学,热能工程,2013,硕士.
[3]周鑫.256光电管阵列四象限CMOS光电传感器研究[D].浙江大学,微电子与固体电子学,2004,硕士.
[4]杜蒙蒙.履带式微耕机及其主要工作部件的性能研究[D].河南科技大学,农业机械化工程,2014,硕士.
[5]徐纯华.微电网并网控制技术及优化研究[D].燕山大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[6]张成群.鲜切蒲菜保鲜工艺及其应用研究[D].南京农业大学,食品工程,2012,硕士.
[7]马婧嶔.关于门静脉系统血栓的若干特殊问题研究[D].复旦大学,临床医学,2013,博士.
[8]路留生.我国机床工业的发展概况及现状[J].安阳大学学报.2002(04)
[9]祝龙娃.上市公司股权制衡与公司绩效关系研究[D].浙江理工大学,企业管理,2013,硕士.
[10]黎东.Cu~(2+)、Zn~(2+)对罗氏沼虾生长以及卵巢发育的影响[D].广东海洋大学,水产养殖,2013,硕士.
[11]荣珏.基于.net架构下的联机分析系统[D].昆明理工大学,2004.
[12]姜耀俭,范慎荣.关于石油管道企业HSE管理体系、环境管理体系和职业安全健康管理体系的整合探讨和建议[J].中国安全科学学报.2002(04)
[13]邹曦.贵州少数民族地区土改问题研究[D].山东大学,中国近现代史,2013,硕士.
[14]张建民,许群,任玉美,李静.液晶态氧化石墨烯诱导纤维素纳米晶自组装及其性能研究[A].中国化学会高分子学科委员会.2014年两岸三地高分子液晶态与超分子有序结构学术研讨会摘要集[C].中国化学会高分子学科委员会:,2014:1.
[15]江建良.慢性心力衰竭患者血浆sFas与sFasL水平的变化及其临床意义[D].苏州大学,心血管内科学,2003,硕士.
[16]刘子钰.信誉与商事法律[D].吉林大学,法学理论,2014,硕士.
[17]赵豫云.唐代文学与谶纬文化关系研究[D].陕西理工学院,中国古代文学,2014,硕士.
[18]胡胜.我国中小企业可持续发展问题与对策研究[D].华中农业大学,农业经济管理,2001,硕士.
[19]白莹.JC15型柴油机结构设计及匹配试验[D].山东大学,动力工程（专业学位）,2012,硕士.
[20]冀倩倩.糖原合成酶激酶-3α，β在糖尿病小鼠肾组织中的不同分布及表达[D].华中科技大学,内科学,2013,硕士.
[21]王雯.从《顺天时报》看晚清的“相公堂子”[D].山西师范大学,戏剧戏曲学,2014,硕士.
[22]马雪飞.汉代的豪族与儒学的关系[D].鲁东大学,专门史,2013,硕士.
[23]那嘉,王伟.数据挖掘方法与工具[J].黑龙江气象,2005,03:45-46.
[24]陈祚雄.盗窃罪五种具体类型的司法认定[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[25]张洁.我国国有企业政治战略选择及绩效分析[D].湖北工业大学,政治学理论,2013,硕士.
[26]潘峰.我国中小企业融资难问题研究[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[27]阚忠良.数字图书馆中基于结构和内容的文本信息检索技术的研究[D].黑龙江大学,2002.
[28]孙夕平,张研,张永清,周超.地震拓频技术在薄层油藏开发动态分析中的应用[J].石油地球物理勘探,2010,05:695-699+792+619.
[29]李雅楠.中国矿产冲突时空分布研究[D].华中科技大学,土地资源管理,2013,硕士.
[30]马志霞.高校思想政治教育文化环境功能研究[D].西南大学,思想政治教育,2014,硕士.
[31]刘君强,潘云鹤.挖掘空间关联规则的前缀树算法设计与实现[J].中国图象图形学报,2003,04:118-122.
[32]宋寅.我国上市银行股权结构与经营绩效关系的实证研究[D].中国政法大学,企业管理,2013,硕士.
[33]武晓丹.助产士参与产前门诊对正常孕产妇分娩结局影响的研究[D].复旦大学,护理学,2012,硕士.
[34]代杰.基于位移信息的均质土坡稳定性分析[D].西南交通大学,岩土工程,2013,硕士.
[35]高石磊.热休克蛋白90在急性髓系白血病患者血清中的表达及临床意义[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[36]李意群.用价电子结构分析元素Y、Sn对Mg-A1合金性能的影响[D].郑州大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[37]房倩,张顶立,王毅远,李鹏飞,李倩倩.圆形洞室围岩破坏模式模型试验研究[J].岩石力学与工程学报,2011,03:564-571.
[38]张睿.884PC在转炉炼钢副原料控制中的应用[J].冶金自动化,1992,01:51-52.
[39]刘振夏,丁持文,刘晓喜,潘文锋,钱绍瑚.高分辨率三维地震勘探数据采集技术[J].石油地球物理勘探,1999,01:37-44+64-122.
[40]胡益斌.可扩展、周期精确、快速多核模拟器研究[D].复旦大学,计算机软件与理论,2012,硕士.
[41]宋得雨.基于CFD的餐厨垃圾生化处理设备温度场仿真研究[D].北方工业大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[42]娜日苏.天山二中蒙语授课教师教育技术能力的现状分析及提高对策研究[D].内蒙古师范大学,现代教育技术（专业学位）,2012,硕士.
[43]袁大军,尹凡,王华伟,黄清飞,肖衡.超大直径泥水盾构掘进对土体的扰动研究[J].岩石力学与工程学报,2009,10:2074-2080.
[44]曹扬.重载矿用自卸车油气悬挂研究[D].西南交通大学,车辆工程,2014,硕士.
[45]张志朋.基于SNS社交平台的企业网络营销策略研究[D].北京交通大学,2012.
[46]顾蕊.闭环供应链框架下再制造的战略决策与科学发展[D].南京航空航天大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[47]戴思远.六氟环氧丙烷的合成工艺研究[D].浙江大学,应用化学,2014,硕士.
[48]王艳萍.五年一贯制学前专科教育专业教材选用研究[D].西南大学,学前教育学,2013,硕士.
[49]毛国栋.钢筋混凝土框架结构在地震作用下破坏机理的研究[D].西安科技大学,结构工程,2014,硕士.
[50]杨景乔.试述涉外产品责任的法律适用[D].西北大学,国际法学,2013,硕士.