HEK293T细胞中siRNA干扰沉默Apc11对细胞周期的影响及APC11L与NKD2的蛋白相互作用与功能研究

【摘要】APC复合体(促后期复合物,Anaphase-PromotingComplex/Cyclosome)参与了很多细胞周期调节因子的泛素化作用。它参与的蛋白质降解系统的功能失调可能导致细胞增殖紊乱、基因组不稳定和肿瘤的发生。APC11是APC复合体中具有泛素连接酶E3催化结构域的蛋白质,本论文包括两部分,第一部分是关于siRNA干扰沉默Apc11对于细胞功能影响以及APC11L功能的初步研究；第二部分是关于APC11L和NKD2的相互作用及其功能的研究。在论文的第一部分,我们通过比对分析现在已知的人类APC11的7个mRNA剪切本,发现这7个剪切本可以编码2种蛋白质,并且根据长度不同,我们分别命名为APC11S和APCllL。我们在CDS区和3UTR各设计了2条干扰序列,可以干扰抑制Apcll,RT-PCR鉴定得到2条有效地干扰序列,干扰的程度分别是50%和80%,在HEK293T中,对瞬时转染后的细胞绘制生长曲线发现siRNA干扰沉默促进了细胞的增殖。在干扰同时通过外源分别转染APC11L、APC11S,结果发现2种蛋白质都可以一定程度挽救siRNA干扰引起的促生长的效应,表明APC11L可能在细胞周期中也发挥一定的作用。我们通过GST-PULLDOWN实验发现：APC11L与APC11S都可以与APC复合体的APC2结合,表明二者可能竞争性结合APC2。亚细胞定位的结果也发现APC11L和APC11S的分布相似,都在细胞间期弥散分布于核周的细胞质中。在细胞分裂过程中的染色质上和细胞质中也检测到APC11L。细胞转染过量表达实验发现在Nocodazole同步化的HEK293T细胞中,APC11L促进CCNB1的降解,抑制AURORA-A的降解。通过荧光素酶报告基因检测了APC11L对于不同信号通路的影响,结果发现APC11L对于个信号通路都只有微弱的影响,AP1、AP1-PMA、CRE、GRE、HRE、WNT和C-MYC等促进细胞增殖的通路呈现下调趋势,并且一定程度的激活了E2F、NFAT、NF-kappaB、p53和RB通路。由于APC11L拥有与APC复合体的核心催化亚基APC11S的N末端序列,可以挽救siRNA干扰沉默Apc11的效应,并且可以影响CCNB1和AURORA-A的降解。因此本文发现APC11L对于促进增殖的各个信号通路有比较小的下调作用,为深入研究APC11L的功能及其对细胞周期的调控机制提供了新的线索。在论文的第二部分,我们用酵母双杂交的方法以APC11L为诱饵筛选人肝cDNA文库,首次得到了一个新的相互作用蛋白NKD2,并通过GST-Pulldown和细胞免疫共沉淀的实验分别在体外和体内验证了这种相互作用的特异性,同时还发现了两者之间相互作用的锌离子依赖性。我们进一步在Hela细胞中证实这两种蛋白质在分裂间期和分裂期都可以共定位在一起。通过测定Hela细胞的NKD2稳转株细胞的细胞周期,我们还发现NKD2可以抑制细胞生长,而且这种抑制是通过延缓细胞周期中M/G1的进程速度实现的,NKD2可以抵消APc11L对APC复合体中期到G1期的底物的影响,但是对前中期的底物没有这样的作用。而且镜检观察发现同时表达2种蛋白质的细胞会出现多核的现象。我们推测NKD2的这种作用是通过改变APC11L的定位实现的。NKD2通过APC11L影响APC复合体的现象,为研究癌症机理提供了新的线索。
【作者】石羽杰；
【导师】霍克克；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2009，博士
【关键词】APC11；RNAi；过量表达；细胞增殖；酵母双杂交；NKD2；泛素化；调控；HOXC10；CCNB1；AURORA-A；

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