人胚胎干细胞向功能性肝细胞定向分化方法的优化研究

【摘要】干细胞技术是当今再生医学研究领域最为前沿的科学，特别是人类的胚胎干细胞（embryonicstemcells，简称“ES细胞”），自1998年建系以来，因其优越的分化潜能和高度的自我更新，受到世界范围内研究人员的广泛关注，在临床疾病治疗方面，也具有着优越的应用前景。ES细胞向成熟功能性肝细胞分化的过程，共分为4个阶段：内胚层的诱导分化阶段、肝特异性细胞的诱导分化阶段、成肝细胞的扩增阶段和肝细胞的成熟阶段。每个阶段都依靠不同的细胞分化因子进行诱导。在本课题中，课题组在细胞分化的起始及扩增阶段，加入了B27作为优化诱导因子。同时，在分化的肝细胞成熟阶段，改变了经典的抑瘤素M（OSM）、地塞米松（Dex）等因子的诱导方式，直接采用HCMTMSingleQuots培养基进行诱导分化。然后，对于分化各个阶段，从形态变化、特异蛋白表达、基因表达等方面进行了检测，特别是对ES细胞衍生的成熟肝细胞进行了功能学评价，从糖原合成、吲哚菁绿代谢能力以及低密度脂蛋白吸收功能三个方面进行了检测，从而全面评价本课题中分化方法在临床治疗方面的可应用性。研究结果显示：应用本方法可以成功地将人源ES细胞分化为成熟的功能性肝细胞。在分化的终末阶段，细胞呈现典型的肝细胞状态；在内胚层细胞的诱导分化阶段，细胞表达内胚层特异性蛋白FOXA2和SOX17；在成肝细胞的扩增阶段，ES细胞分化的肝细胞，也具备了一定肝前体细胞的特性，表达AFP和HNF4α；在最后肝细胞成熟阶段，ES细胞分化的成熟肝细胞的特异蛋白ALB和HNF4α均呈阳性表达，而且表达的效率在90%以上。在功能检测方面，研究结果表明：在功能学上，ES细胞分化的成熟功能性肝细胞与真正的人体成熟肝细胞具有较高的一致性。具体来讲，ES细胞分化的肝细胞具有糖原合成和储备的能力。同时，具有代谢吲哚菁绿的能力，以及吸收低密度脂蛋白的功能。更为重要的是，在基因检测方面，与原有的经典实验方法相比，尽管在多能性基因（POU5F1、SOX2和NANOG）的表达调控方面，未见明显的区别。但是，在肝细胞特异性基因（SOX17、HNF4α和ALB）的表达调控方面，本课题的诱导分化方法可以显著提高中后阶段部分肝细胞特异性基因（HNF4α和ALB）的表达水平，从而达到了优化ES细胞向功能性肝细胞定向分化的目的。总的来讲，本课题以人源ES细胞的肝向分化技术研究为核心，以现有的分化平台为基础，通过细胞分化过程中诱导因子的优化，改善人源ES细胞向成熟功能性肝细胞的分化效率，从而建立一种高效诱导人源ES细胞分化为功能性肝细胞的方法。所以，本课题为肝细胞的发生发育研究和肝脏疾病药物筛选建立了一种新的体外模型，同时，也为人源ES细胞在临床肝脏疾病的治疗应用方面提供一定的理论基础和技术支持。
【作者】冯业童；
【导师】周余来；
【作者基本信息】吉林大学，生物医学工程，2014，硕士
【关键词】胚胎干细胞；肝细胞；分化；功能；

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