白头翁和委陵菜ITS和TrnL-F序列分析及鉴别方法的建立

【摘要】中药的应用起源于我国，具有悠久的历史。我国古代人们依据自己的经验总结了一整套中药应用理论，为挽救人们生命，减少人们痛苦做出了巨大贡献。在古代随着东西文化的交流，中药应用理论传入西方，但中药应用没有受到人们的广泛重视。近些年随着西方国家对中药价值的认可以及我国中药现代化的提出，为中药走向世界舞台提供了重要的机遇。在中药的应用过程中，常常出现误用、混淆等现象，给人们的用药安全带来威胁，因此中药鉴别伴随中药的应用而兴起。传统的鉴别方法有形态学、显微鉴别、化学成份、薄层色谱、高效液相色谱等方法，但这些传统方法常常受到很多因素的制约，影响其准确性、精确性和重现性。因此，特别需要一种简便、快速、准确、重现性好的鉴别方法，以便提高人们用药安全。近些年，随着分子生物学的快速进展，小片段的基因作为一种鉴别手段经常被人们应用于植物种属分类。由于其所具有的独特优势，小片段基因也频繁地被应用于中草药的鉴别。植物ITS序列是核糖体内转录间隔序列，长度一般为600-700bp，在植物基因中为中度重复序列，在进化过程中比较保守，但在种属间又有差别，因此常常被人们应用于植物种属分类。由于其长度适宜，在基因中为中度重复，基因扩增比较容易等优点，因此在药用植物鉴别中比较适合作为鉴别的依据。trnL-F序列在叶绿体中也是中度重复序列，其长度一般为800-900bp左右，由于中度重复，因此在基因扩增中比较容易，长度适宜，测序和序列分析工作量较小，也常常被人们应用于植物种属分类以及鉴别。因此，ITS和trnL-F序列作为中药鉴别手段是合理的、可行的。白头翁和委陵菜虽属不同种属，形态有所差异，但由于历史原因，不同地方把委陵菜习称为白头翁。再者在中药的实际应用过程中，经常对中药进行加工等工序，处理过的中药植物在形态上比较难以鉴别，而传统方法又受到很多因素的制约，因此，需要一真确、快速、重现性好的鉴别方法来鉴别，确保人们用药安全。本文正是基于此，从ITS和trnL-F序列入手，希望能够找出鉴别白头翁和委陵菜的方法，为其他中药鉴别提供新的思路。从实验结果来看，虽然白头翁和委陵菜不属同一种属，但ITS序列差异不是很大，白头翁ITS长为601bp；委陵菜ITS为661bp。白头翁trnL-F长为661bp；委陵菜trnL-F长为721bp。从长度来说白头翁ITS和trnL-F序列比委陵菜ITS和trnL-F序列短，白头翁ITS序列和trnL-F序列均低于正常值。从ITS序列比对图中能够看出，白头翁和委陵菜在前60个碱基处差异较大，另外除390-400bp碱基处有差异外，其余基本一致；从trnL-F序列比对图中能得出，在695bp-759bp碱基处有很大差异，其余就散落几处不同。总体来说,白头翁和委陵菜在ITS和trnL-F序列虽有差异，但差异不是很大，但这些序列差异足以能鉴别白头翁和委陵菜。通过软件Primer5.0对白头翁和委陵菜ITS序列进行分析，得到白头翁在233bp碱基处有一个BtgI酶切位点，而委陵菜则是在629bp碱基处有一个BtgI酶切位点，因此，通过限制性内切酶BtgI能够对白头翁和委陵菜进行鉴别；对白头翁和委陵菜trnL-F序列分析得到，在白头翁580bp碱基处有一个RsaI酶切位点，而委陵菜则没有，因此，通过RsaI也能鉴别白头翁和委陵菜。从酶切结果电泳图来看，ITS和trnL-F序列酶切鉴别能够非常好的区分白头翁和委陵菜药用植物，因此本方法可行。
【作者】王伯川；
【导师】张绍轩；
【作者基本信息】吉林大学，生物医学工程，2014，硕士
【关键词】白头翁；委陵菜；ITS序列；trnL-F序列；分子鉴别；

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