人FXYD6单克隆抗体库的制备及其在胆管癌诊断中的应用

【摘要】第一部分人FXYD6抗原的表达与纯化目的：构建含人FXYD6胞内区-G4S-FXYD6胞外区-G4S-GST-His6TAG基因序列的原核表达质粒，并诱导其表达，并对表达出的蛋白进行纯化。方法：构建去除FXYD6跨膜区域的FXYD6胞内区-G4S-FXYD6胞外区-G4S基因片段，插入原核表达载体pET30a-GST中，以重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21，SDS-PAGE检测蛋白表达情况，重组蛋白经镍柱纯化后，SDS-PAGE检测蛋白纯度，BCA法检测浓度。结果：成功构建了原核表达载体pET30a-GST-FXYD6，诱导后重组蛋白大小与预期相符在33kD-45kD之间，其纯度在90%以上。结论：成功制备出了FXYD6重组蛋白，为制备FXYD6胞外区和胞内区的单克隆抗体库奠定了基础。第二部分人FXYD6单克隆抗体库的制备与签定目的：研制抗人FXYD6功能区单克隆抗体库，并对其进行签定及筛选分泌胞内、胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法：以去除跨膜区域FXYD6功能区重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经多次筛选及克隆化，建立可稳定分泌抗人FXYD6胞外区及胞内区的单克隆抗体杂交瘤。用间接ELISA、蛋白免疫印迹签定特异性及亚型，再用间接ELISA法通过合成的胞外区多肽筛选出分泌胞外区、胞内区的FXYD6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用免疫组化方法筛选可识别天然构象的胞外区单克隆抗体，用腹水诱导法对胞外区单克隆抗体进行制备、纯化并检测亲和常数。用真核表达质粒pcDNATM3.1/myc-His(-)B-FXYD6瞬转上调FXYD6蛋白表达的293T细胞在体外检测胞外区抗体功能。结果：成功制备了6株能持续分泌的胞内区抗体的杂交瘤，2株持续分泌胞外区抗体的杂交瘤，这8株杂交瘤分泌的抗体可特异性识别天然构象的人FXYD6蛋白，2种胞外区单克隆抗体的亲和常数均在1010以上，这两种抗体均属于阻断功能性单抗。结论：成功制备了分泌抗人FXYD6胞外区及胞内区单克隆抗体的杂交瘤细胞库和制备了两种具有阻断性功能的胞外区单抗，为进一步研究其组织分布及作用机制签定了基础。第三部分FXYD6在胆管癌中的表达及其生物学意义目的：探讨FXYD6蛋白在胆管癌组织及相应远端正常胆管组织的表达情况，同时分析其在胆管癌中的表达与临床病理学特征的关系。方法：我们应用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）免疫组织化学法检测72例胆管癌和远端正常胆管中FXYD6蛋白的表达，分析FXYD6表达与胆管癌临床病理学特征的关系。结果：FXYD6在胆管癌组织中的阳性表达率明显高于相应胆管组织的阳性表达率（69%vs.33.3%；p=0.002），而且FXYD6在高、中分化的胆管癌中的阳性表达明显高于低分化及粘液癌中的阳性表达（85.7%vs.40%；p=0.000）。FXYD6在正常胆管中的表达与解剖部位无关（p=0.945）。其在胆管癌中的表达与性别（p=0.393）、年龄（p=0.174）、组织学类型（p=0.123）、T分期（p=0.164）、淋巴结转移（p=0.343）、神经浸润（p=0.088）及肿瘤位置（p=0.238）无关。结论：FXYD6是胆管癌的一种新型肿瘤生物标记物，与胆管癌分化程度相关，其在胆管癌中的高表达可能提示较好的临床预后。
【作者】陈雄飞；
【导师】周宁新；
【作者基本信息】苏州大学，普通外科，2014，博士
【关键词】FXYD6；载体构建；原核表达；蛋白纯化；单克隆抗体；制备；签定；胆管癌；Na,K-ATPase；分化程度；

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