IL-6神经保护作用的钙离子通道机制及信号转导途径

【摘要】白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）是目前发现的几十种细胞因子中的一种。过去认为IL-6主要与免疫系统和造血系统中细胞的诱导、生长和分化有关。但现在的研究发现，IL-6也存在于中枢神经系统（centralnervoussystem,CNS）中，而且来源于脑细胞的内源性生成。尽管正常脑内IL-6水平较低，但在神经系统功能紊乱时，例如：脑损伤、神经变性、感染、缺血和多发性硬化等，IL-6浓度迅速及明显地增加，这提示IL-6与神经系统疾病关系密切。已有研究说明IL-6具有神经保护作用。我们实验室先前的研究也表明IL-6能够抑制谷氨酸或N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）诱发的细胞内钙超载，因而具有神经保护效应。然而，IL-6抑制细胞内钙超载继而产生神经保护作用的机制仍不清楚。为此，本研究利用膜片钳、钙成像、形态学和分子生物学等实验技术，从神经元膜上电压门控性钙通道（voltage-gatedcalciumchannel,VGCC）和NMDA受体（NMDAreceptor,NMDAR）通道的角度来研究IL-6抑制细胞内钙超载的机制，并进一步以IL-6信号转导途径与NMDAR离子通道的联系为切入点来探讨IL-6神经保护作用的机制。研究揭示了IL-6一方面经抑制L-型钙通道（L-typecalciumchannel,LCC）的活动减少细胞内钙超载，另一方面通过Janus激酶（JanusKinases，JAKs）-信号转导和转录活化因子3（signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3）-钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）的信号途径抑制NMDAR亚基NR2B和NR2C的活动减少了细胞内钙超载从而发挥神经保护作用。本研究可为IL-6在神经系统疾病中的作用及作用机制提供更多新的证据。第一部分IL-6经抑制L-型电压门控性钙通道的活动减少神经元内钙超载目的：说明IL-6抑制神经元内钙超载的细胞膜上VGCC的类型及机制。方法：1.IL-6（120ng/ml）预处理小脑颗粒神经元（cerebellargranuleneurons,CGNs）24h，然后应用膜片钳技术，在全细胞记录模式下，观察IL-6对培养的CGNs全细胞钙通道电流和LCC电流的作用。2.钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记CGNs，应用共聚焦激光扫描显微镜（confocallaserscanningmicroscope，CLSM）检测LCC拮抗剂nifedipine和IL-6+预处理对高K诱发的细胞内钙超载的影响。3.Westernblot方法检测IL-6对培养的CGNs表达LCC亚基Cav1.2水平的影响。结果：1.将细胞钳制电压设为-80mV，在去极化电压至-20mV，-10mV，0mV和10mV四个阶跃电压下，IL-6预处理细胞的全细胞钙通道电流密度要低于对照组（未经IL-6预处理的细胞），表明IL-6可抑制全细胞钙通道电流。2.将细胞钳制电压设为-80mV，去极化电压至-10mV时，IL-6预处理细胞的全细胞LCC的电流密度要低于对照组，而全细胞非LCC的电流密度与对照细胞无明显差异。经Boltzmann方程拟合，IL-6预处理细胞与对照组细胞比较，电压激活曲线的半激活电压和斜率因子无统计学差异。这些结果说明IL-6抑制了LCC的钙电流，但未影响其通道的激活特征。3.+高K（KCl）诱发了明显的神经元内Ca2+浓度升高。神经元用LCC拮抗剂nifedipine++预处理后，高K激发的胞内钙超载被减弱，说明高K促使LCC的开放，导致Ca2+内流增加。4.神经元经IL-6+预处理后高K诱发的细胞内钙超载被抑制。并且，IL-6也明显2+抑制了神经元经LCC流入的Ca。5.IL-6预处理明显下调神经元LCC亚基Cav1.2的蛋白表达。结论：IL-6经下调神经元LCC亚基Cav1.2的水平抑制了LCC的活动，从而减少了经LCC2流入的Ca+，抑制了细胞内钙超载，这是IL-6发挥神经保护作用的一种机制。第二部分IL-6抑制NMDA诱导的神经元钙超载和凋亡的受体通道机制及信号转导途径目的：说明IL-6经神经元内JAK-STAT3-CaN的信号转导途径抑制了NMDAR亚基NR2B和NR2C的活动，从而减少NMDA诱导的神经元钙超载和凋亡而发挥神经保护作用。方法：1.IL-6（120ng/ml）预处理CGNs24h后，再分别用胞内钙库耗竭剂毒胡萝卜素（thapsigargin,TG），NMDAR亚基的拮抗剂NVP-AAM077、ifenprodil和PPDA，JAK-STAT3-CaN信号通路的抑制剂AG490和FK506处理神经元。2.用钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记已用IL-6和上述各种药物处理后的神经元，利用CLSM观察神经元在NMDA（100μM）激发下，胞内钙荧光强度的动态变化。3.应用膜片钳技术，在全细胞记录模式下，观察IL-6及结合使用上述各种药物处理后的神经元对NMDA诱发电流的影响。4.利用JC-1试剂盒，检测神经元在用IL-6及上述各种药物处理后对NMDA刺激下的线粒体膜电位的影响。5.使用TUNEL荧光标记法，观察神经元在用IL-6及上述各种药物处理后对NMDA诱发的神经元凋亡的影响。6.Westernblot方法分别检测IL-6及上述各种药物处理后，神经元在NMDA刺激下的NMDAR必需亚基NR1和调节亚基NR2A、NR2B、NR2C的表达水平及其磷酸化水平。7.通过比色法和Westernblot方法分别检测CaN的活性水平和表达水平，观察神经元用IL-6和AG490处理后，在NMDA刺激下的CaN的活性水平和表达水平的变化。结果：1.NMDA激发神经元内钙荧光强度升高至基础水平的1.84倍。神经元用胞内钙+库耗竭剂TG预处理后，NMDA2仍可激发细胞内Ca水平升高，说明NMDA激活细胞膜上NMDAR离子通道使Ca2+内流增加。IL-6可减少TG处理后NMDA激发的细2+2+胞内Ca升高，表明IL-6可抑制Ca经NMDAR离子通道的流入。2.NMDA的诱发电流可以被NMDAR拮抗剂MK-801所阻断，表明NMDA的诱发电流经NMDAR介导。经IL-6预处理的神经元，NMDA诱发电流的密度要明显低于未经IL-6处理的细胞，说明IL-6可抑制NMDAR介导的内向电流。3.NMDAR亚基NR2B的拮抗剂ifenprodil和NR2C的拮抗剂PPDA均显著抑制了NMDA诱发的细胞内钙超载，但NR2A的拮抗剂NVP-AAM077不能显著抑制NMDA诱发的细胞内钙超载，说明在NMDAR离子通道介导的Ca2+内流中，NR2B和NR2C起关键作用。IL-6预处理的神经元，ifenprodil和PPDA对NMDA诱发的胞+内Ca2升高的抑制率低于未用IL-6预处理的神经元，而NVP-AAM077并未表现出这种差异，表明IL-6主要抑制了NR2B和NR2C亚基的功能。4.IL-6预处理的神经元，ifenprodil和PPDA对NMDA诱发的内向电流的抑制率明显低于未用IL-6预处理的神经元，而NVP-AAM077并未表现出这种差异，进一步说明IL-6主要通过抑制NR2B和NR2C亚基的功能从而减少NMDA诱发的内向电流。5.IL-6预处理的神经元，ifenprodil和PPDA对NMDA诱发细胞凋亡的抑制率要明显低于未用IL-6预处理的神经元，表明IL-6经抑制NR2B和NR2C亚基的活动发挥抗凋亡作用。6.IL-6下调神经元的NR2B和NR2C的蛋白表达，也下调NR2C的磷酸化水平，但对NR2A的表达和磷酸化水平无明显作用。7.JAK-STAT3信号通路的抑制剂AG490和CaN的抑制剂FK506均可以阻断IL-6抑制NMDA诱发的神经元内钙超载。并且，AG490和FK506也阻断IL-6抑制NMDA诱发的内向电流。8.IL-6预处理神经元抑制了NMDA导致的线粒体膜电位下降，而AG490和FK506均阻断了IL-6的这种作用。9.IL-6预处理神经元显著抑制了NMDA诱发的细胞凋亡，AG490和FK506均阻断了IL-6的抗凋亡作用。10.IL-6预处理神经元上调了CaNβ亚基蛋白的表达，同时拮抗了由NMDA诱导的CaN活性的降低。AG490阻断了IL-6的这种作用。结论：1.IL-6抑制神经元膜上NMDAR通道的活动，因此减少了由NMDA激发的胞2外Ca+经NMDAR通道流入细胞内。2.IL-6通过抑制神经元内NMDAR通道亚基NR2B和NR2C的表达及活动，从而减少NMDA诱发的胞内钙超载和神经元凋亡。。3.IL-6激活神经元内JAK-STAT3-CaN的信号通路，继而抑制神经元膜上NMDAR通道的活动，发挥神经保护作用。
【作者】马颂华；
【导师】邱一华；
【作者基本信息】苏州大学，人体解剖与组织胚胎学，2014，博士
【关键词】IL-6；钙超载；L-型电压门控性钙通道；NMDA；JAK/STAT3；钙调神经磷酸酶；小脑颗粒神经元；

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