水葫芦谷氨酰胺合成酶基因的克隆及表达

【摘要】谷氨酰胺合成酶(GS)在高等植物氮代谢中起着重要的作用,是参与氨同化过程的关键酶。植物GS具有多种同工酶,根据亚细胞定位,分为胞液型谷氨酰胺合成酶(GS1)和质体型谷氨酰胺合成酶(GS2)。水葫芦在富营养化水体中泛滥生长,会破坏水体生态平衡。但水葫芦具有过度吸收氮磷营养元素的特点,适量的水葫芦可用来净化水质。本文基于大豆、小麦等植物GS1基因保守序列,以水葫芦根部RNA为模板经过两步法RT-PCR法扩增出水葫芦GS1的保守序列片段,再经RACE(Rapid-amplificationofcDNAends)法,克隆了3个完整的GS1基因(Eichhorniacrassipesglutaminesynthetase,分别标号为EcGS1a,EcGS1b,EcGS1c),3个基因全长分别为1434bp、1455bp、1508bp。EcGS1a编码一个356个氨基酸残基的多肽,推测的多肽分子量大小为39.3kDa,PI=5.52。EcGSlb编码一个354个氨基酸残基的多肽,推测的多肽分子量大小为39.0kDa,PI=5.95。EcGSlc编码一个356个氨基酸残基的多肽,推测的多肽分子量大小为39.3kDa,PI=5.94。通过氨基酸序列和结构分析显示EcGS1a、EcGSlb和EcGS1c蛋白包都含了ATP结合区域,N-糖基化序列,GSbeta-Grasp功能区和GS催化功能区,这些功能区在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的。通过亚细胞定位预测EcGS1a、EcGS1b和EcGS1c蛋白都为胞质型蛋白。通过BLAST分析及进化树构建可知EcGS1a、EcGS1b和EcGS1c氨基酸序列与橡胶树的相似性最高。本实验还对清水、铵态氮及硝态氮三种不同培养条件下,水葫芦根部和叶部的EcGS1a、EcGS1b和EcGS1c转录水平和GS活性进行了分析。在根部,EcGS1a和EcGS1c基因的转录主要受硝态氮影响；EcGS1b基因的转录受外界氮素形态影响不大；GS活性在氮胁迫和铵态氮处理初期受到了抑制,随着处理时间GS活性的抑制解除,GS活性在硝态氮处理2h和6h时受到了明显的抑制。在叶部,在清水,氯化铵,硝酸钾处理下,EcGS1a,EcGS1b和EcGS1c基因的转录都提高了,EcGS1a基因的转录受氮胁迫的影响最为显著,表现为氮胁迫转录增强；EcGSlb和EcGSlc基因的转录受硝酸钾的影响最显著；GS活性不受氮胁迫的影响,在氯化铵处理2h时和硝酸钾处理4h时下明显提高。
【作者】蒋丽花；
【导师】傅明辉；
【作者基本信息】广东工业大学，生物化工，2014，硕士
【关键词】水葫芦；谷氨酰胺合成酶；克隆；RACE；转录；荧光定量PCR；酶活；

【参考文献】
[1]陶彦玲.论知识管理在信息化教育中的应用[D].西北师范大学,2005.
[2]杨超峰.KF公司标准化推行方案与模式研究[D].兰州大学,工商管理,2012,硕士.
[3]杜恭贺.石墨烯及其掺杂体系电子结构性质的理论研究[D].西北大学,2010.
[4]黄玲.蛇莓体外抗菌及体内调节免疫作用的研究[D].四川农业大学,基础兽医学,2012,硕士.
[5]邵小卷.集装箱内陆空箱场站选址研究[D].大连海事大学,物流工程,2014,硕士.
[6]杨文航.SiC单晶化学机械抛光过程中的化学作用研究[D].哈尔滨工业大学,化学工程与技术,2014,硕士.
[7]宋云杉.马克思恩格斯城乡关系思想及其当代价值研究[D].西南大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[8]邹凯.高速铁路高架桥列车运营对既有线路基应力状态的影响[D].北京交通大学,2014.
[9]罗利红.超声声孔效应增敏兔VX_2肿瘤化疗效果的实验研究[D].南方医科大学,影像医学与核医学,2012,硕士.
[10]刘辉.网络物流中的两个最优算法[D].河北大学,应用数学,2014,硕士.
[11]范昭平.有机质对淤泥固化的影响机理及对策研究[D].河海大学,岩土工程,2004,硕士.
[12]阿贝乐（AbelGLASER）.《黄帝内经》经络理论与精油疗法外用的研究[D].成都中医药大学,中医基础理论,2012,硕士.
[13]张虹.骨肉瘤大剂量化疗后重度骨髓抑制的临床研究[D].山东大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[14]朱美强,程玉虎,李明,王雪松,冯涣婷.一类基于谱方法的强化学习混合迁移算法[J].自动化学报,2012,11:1765-1776.
[15]李胜昔.农村留守儿童监护类型与成长状况研究[D].华中农业大学,行政管理,2014,硕士.
[16]付强.北京市属高校高层次人才引进现状及策略研究[D].北京工业大学,高等教育学,2014,硕士.
[17]温书胜.无线传感网络中实现效用公平的流控制研究[D].浙江理工大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[18]李小倩.电梯群控系统调度策略研究与仿真设计[D].南京航空航天大学,系统工程,2013,硕士.
[19]李全磊.PICC置管前评估的临床实践指南构建[D].复旦大学,护理学,2012,硕士.
[20]董琳.论第三人撤销之诉[D].大连海事大学,法律,2014,硕士.
[21]龙浩.矿井提升机变频并联驱动系统谐波环流抑制研究[D].湖南科技大学,机械工程,2013,硕士.
[22]陈亮亮.肾移植患者尿液Smad2,4,7蛋白检测分析早期发现慢性移植肾肾病[D].宁波大学,泌尿外科,2014,硕士.
[23]郭晓波.Cr、Nb掺杂原位合成Al_2O_3/TiAl复合材料的研究[D].陕西科技大学,材料学,2013,硕士.
[24]刘翠敏.海量图像检索的形状描述符研究[D].大连海事大学,计算机技术,2013,硕士.
[25]陈嘉远.战术数据链时分多址时隙分配算法研究[D].北京交通大学,2015.
[26]刘韧,张礼平,詹因强.分析型CRM系统的构建研究[J].计算机应用与软件,2004,04:46-47+75.
[27]张珩.一类不确定性系统的简单调节[J].自动化学报,1997,05:134-135.
[28]卢凯,徐建闽,郑淑鉴,王世明.协调控制子区快速动态划分方法研究[J].自动化学报,2012,02:279-287.
[29]宋翔.华润彭城电厂DCS系统的改造与应用[D].西安科技大学,控制工程,2013,硕士.
[30]梁侠.论公司章程与公司法规范在公司治理中的冲突与协调[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[31]姜聪.未成年人犯罪刑事和解适用规范化[D].沈阳师范大学,法律,2013,硕士.
[32]谢榭.应急管理视域中网络舆情危机问题的研究[D].湖南师范大学,行政管理,2014,硕士.
[33]郭晓敏.关于短篇小说《莫斯科乡愁》的翻译报告[D].北京外国语大学,翻译,2014,硕士.
[34]马富.损伤及饱和度影响混凝土物质传输性能的研究[D].哈尔滨工业大学,防灾减灾及防护工程,2014,硕士.
[35]童晓阳.基于分层因果规则网和模糊可信度的变电站报警评估方法[J].电力系统自动化,2011,05:36-41.
[36]王成坤.侵染大豆的主要病毒种类及高温对大豆对SMV抗性的影响研究[D].南京农业大学,作物遗传育种,2013,硕士.
[37]唐丽君.白马湖作家群研究[D].西南大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[38]董艳芬.论被害人过错对犯罪人刑事责任的影响[D].南京大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[39]范爱国.清华大学成功制备出自分散柱撑石墨烯[J].兵器材料科学与工程,2014,03:98.
[40]邓佳梁.基于FPGA的面阵CCD成像系统设计[D].华中科技大学,生物医学工程,2013,硕士.
[41]孙慧.《全宋笔记》（第二编）语言学资料类编及其语言学价值研究[D].杭州师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[42]刘美玲.二维光子晶体的负折射与自准直特性研究[D].青岛大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[43]王轶.基于迭代学习控制的几类列车自动控制问题研究[D].北京交通大学,2010.
[44]陶文斌,张粒子,黄弦超.发电机组检修市场的初步设计[J].电力系统自动化,2005,20:19-23.
[45]李艳丽.女性主义视角下的乔治·艾略特悖论性研究[D].河北师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[46]雷冰贤.甘肃省金融支农效率研究[D].兰州商学院,金融学,2013,硕士.
[47]任秀贝.稻纵卷叶螟对杀虫剂抗性的监测与室内饲养技术研究[D].南京农业大学,农药学,2013,硕士.
[48]李蓉.金陵大学影音教育研究[D].西北大学,戏剧与影视学,2014,硕士.
[49]李福元,赵瑞培.复杂地表地震资料的地形校正[J].石油地球物理勘探,2002,S1:31-34+221.
[50]黎志成,王虎.客户关系管理实施研究[J].统计与决策,2004,11:149-150.