ARID1A在肝癌侵袭转移中的作用及其机制研究

【摘要】肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）（简称肝癌）是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，虽然有关肝癌的研究已取得很大进展，但由于其极高的转移/复发率，肝癌病人总体5年生存率仅有5％左右。目前，肝肿瘤切除术和肝移植仍然是治疗肝细胞肝癌最有效的标准方案，因此，探索肝癌转移复发的机制，了解肿瘤的侵袭转移能力，预测患者预后，寻找有效的抑制途径，成为进一步提高肝癌患者生存率的关键。肿瘤的发生发展、转移侵袭是一个复杂的、多因素作用的过程。从分子生物学的角度来看，肝癌是一种基因疾病。是某些染色体上的DNA损伤导致基因突变的结果，包括癌基因、抑癌基因、细胞凋亡基因、细胞周期调节基因、及维持细胞基因组稳定性的基因(如DNA修复、DNA复制及染色体分离基因)等，是一个多阶段逐步演化的过程。AT丰富结合域1A基因（theAT_richinteractivedomain1AARID1A）最早是作为染色质重塑复合物SWI／SNF(switch/sucrosenon-fermenting)家族的一员被人们发现的。近年来的研究表明，它是一个重要的抑癌基因，与细胞增殖密切相关，在肿瘤的发生发展、转移复发过程中发挥重要作用。至今，ARID1A对肝癌的影响尚未有明确报道。本实验主要研究ARID1A基因对肝癌生物学特性的影响。首先，检测ARID1A在40例肝癌及相应癌旁组织以及不同转移潜能肝癌细胞系中的表达差异;接着利用组织芯片技术对396例原发性肝癌手术切除的患者标本进行研究分析，研究ARID1A表达与肝癌发生、发展以及预后的相关性;通过转染与干扰调节ARID1A表达后,进行一系列体外和体内实验，研究ARID1A的表达对肝癌细胞生长增殖、侵袭转移方面的影响，最后探讨ARID1A抗肿瘤效应的可能机制，以期为防治肝癌提供新的靶点。第一部分ARID1A在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达研究目的：研究ARID1A在肝癌细胞株，肝癌及相应癌旁组织中的表达差异，分析其与肝癌发生的关系。方法：应用荧光定量PCR、WesternBlot及免疫组织化学方法检测ARID1A在40例肝癌及相应的癌旁组织和正常肝组织中的表达。应用荧光定量PCR、免疫组织化学及WesternBlot检测不同转移潜能肝癌细胞系中ARID1A的表达情况。结果：Real-timeRT-PCR检测结果分析显示：ARID1A基因在肝癌组织的相对表达量（0.005±0.0003）明显低于癌旁组织（0.0934±0.012），差异有统计学意义（P<0.05）。复发组肝癌组织（0.006±0.0001）ARID1A表达低于未复发组（0.023±0.005），差异有统计学意义（P<0.001）。复发组与未复发组的正常肝组织中ARID1A稳定表达，与预后无相关性。Western-Blot检测结果同样显示肝癌组织ARID1A基因表达低于癌旁组织，差异显著（P<0.05）。复发组与未复发组的正常肝组织中ARID1A稳定表达，与预后无相关性。在细胞研究中：免疫组化显示ARID1A表达情况与肝癌细胞系的转移潜能呈负相关（P<0.05）。Real-timePCR显示，ARID1A的表达，与肿瘤的恶性程度密切相关，ARID1A表达越高，肿瘤的恶性程度越低，ARID1A表达越低，肿瘤的恶性程度越高。结论：ARID1A在肝癌发生、发展中可能有重要的作用第二部分ARID1A表达与肝癌临床病例特征及相关性研究目的：研究ARID1A基因在原发性肝癌中的表达情况，探讨ARID1A在肝癌及癌旁组织中的表达差异、相关性、与原发性肝癌的关系及临床意义。方法：检测包含396例肝癌（癌旁）组织的组织芯片中ARID1A基因的表达情况，统计分析两者与肝癌临床病理特征及预后的关系。结果：ARID1A蛋白的过表达与肝癌患者性别（P=0.036）、血管侵犯（P=0.193）、ALT（P=0.031）、Child-pugh分级（P=0.607)、BCLCstage（P=0.043）有关。ARID1A表达阳性组5年总体生存率及无病生存率明显高于ARID1A表达阴性组。分层Kaplan-Meier分析ARID1A表达显示：在高AFP组、肝硬化组、肿瘤大于5cm组中，肝癌组织中ARID1A过表达的患者OS和DFS高于低表达患者。多因素分析表明肿瘤大于5cm，有微血管侵犯，ARID1A表达阴性是影响OS的独立预后因素；肿瘤小于5cm，无微血管侵犯，ARID1A表达阳性是影响DFS的独立预后因素。结论：肝癌组织中ARID1A的低表达与原发性肝癌的侵袭、转移及预后不良相关。第三部分调节ARID1A基因表达对肝癌细胞侵袭与转移的影响及机制研究目的：研究ARID1A与肝癌细胞侵袭、转移的关系及作用机制方法：利用慢病毒质粒载体在M3和Hep-3B细胞株中分别转染促进ARID1A表达的TALE-VP64质粒和降低ARID1A表达的shARID1A干扰质粒，从而构建M3-ARID1A和Hep3B-shARID1A稳定细胞系。经Western-Blot，qRT-PCR验证ARID1A表达改变后，Transwell法研究细胞迁移、侵袭能力变化；MTT检测细胞增殖能力变化；流式细胞术检测细胞凋亡能力变化。同时研究ARID1A基因表达改变后，细胞中PTEN、PIK3CA、p53、MMP9、VEGF的表达变化；将细胞接种于裸鼠皮下建立成瘤模型，研究转染前后细胞成瘤能力变化，免疫组化检测裸鼠成瘤切片中PTEN，PIK3CA、p53、MMP9、VEGF的表达情况。结果：慢病毒转染下调低转移能力的Hep3B细胞中ARID1A表达和上调高转移能力的HCCLM3细胞的ARID1A表达，建立稳定细胞株。ARID1A表达改变后，体外能明显改变肝癌细胞的迁移、侵袭、增殖和凋亡能力；体内能改变癌细胞成瘤能力。ARID1A上调后，PTEN、p53、PIK3CA基因表达均明显上调，而MMP9和VEGF基因表达均明显下调；ARID1A下调后，PTEN、p53、PIK3CA基因表达均明显下调，而MMP9和VEGF基因表达明显上调。证明ARID1A基因在肝癌中具有明显的抑癌作用。结论：肝癌细胞ARID1A表达上调或下调能降低和促进肝癌的侵袭与转移的能力。
【作者】孙鼎；
【导师】钱海鑫；秦磊；
【作者基本信息】苏州大学，外科学，2014，博士
【关键词】ARID1A；原发性肝癌；侵袭转移；预后；转染；信号转导；

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