骨髓瘤细胞诱导的骨髓间充质干细胞Cx43表达变化及其在多发性骨髓瘤发病中的作用

【摘要】多发性骨髓瘤（MM）是浆细胞在骨髓中异常增生的恶性肿瘤，这些异常增生的浆细胞与骨髓基质细胞密切相关。MM细胞与骨髓微环境可通过直接接触及分泌细胞因子的方式间接相互作用。在MM的发展过程中，骨髓微环境逐渐表现出支持MM细胞生存和增殖的特征。骨髓间充质干细胞（BMSCs）参与构建骨髓微环境，参与促进MM细胞的生长及骨破坏的发生；同时，MM细胞对骨髓微环境重塑使其成为适合MM细胞生存和增殖场所。目前，此过程中涉及的具体机制尚未完全阐明。间隙连接是普遍存在的一种细胞间连接方式，相邻细胞间通过间隙连接介导的细胞间隙连接通讯(GJIC)进行着信息和能量物质的交换，对细胞增殖、分化等生理过程起着重要的调控作用。间隙连接蛋白43(Cx43)是在人体表达最高的一种间隙连接物质，可在包括造血干细胞、基质细胞等多种细胞表达，参与造血调控。Cx43表达及功能异常在多种肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。那么在MM的发生、发展中，MM细胞及BMSCs如何相互作用，是否发生间隙连接的表达或功能改变，其改变又有怎样的生物学效应？我们通过建立MM细胞与BMSCs的共培养体系，研究MM细胞对BMSCsCx43表达及功能的影响以及此过程中MM细胞及BMSCs的生物学行为的变化，从而进一步探讨MM的发病机制。本课题为国家自然科学基金项目（NO81071934/H1616）“接头蛋白Cx43在多发性骨髓瘤成骨细胞巢重塑中的作用”的重要研究内容，该实验完成为此项目的结题、文章发表及延伸课题的申报奠定基础。第一部分Cx43在骨髓瘤细胞和骨髓间充质干细胞的表达及生物学功能目的：检测人MM细胞及BMSCs的Cx43表达，探讨间隙连接在BMSCs诱导的MM细胞的迁移、粘附中的作用及其对BMSCs的基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）分泌的影响。方法：贴壁培养法分离培养人BMSCs，CD138磁珠及midiMACs分选原代MM细胞，流式细胞仪测定BMSCs及原代MM细胞的免疫表型。Westernblot及免疫荧光检测Cx43在BMSCs的表达。CCK-8法检测间隙连接阻断剂18α-甘草次酸（18α-GA）对MM细胞及BMSCs增殖的作用；微孔隔离实验检测18α-GA对BMSCs诱导的MM细胞迁移、粘附能力的影响。ELISA检测BMSCsSDF-1α分泌水平。结果：1）MM细胞系RPMI8226、U266及1例原代MM细胞中、低度表达Cx43，XG-4、XG-7细胞不表达Cx43。BMSCs高表达Cx43。初诊MM患者的BMSCs（MM-MSC）Cx43表达高于正常供者的BMSCs（ND-MSC）。2）18α-GA对RPMI8226细胞和BMSCs的增殖无明显影响。3）18α-GA抑制BMSCs的SDF-1α分泌，其作用前后SDF-1α浓度分别为（237.84±9.23）pg/ml、（94.31±6.44）pg/ml（P<0.01）。4）18α-GA可抑制BMSCs诱导的MM细胞迁移，BMSCs经其作用前后RPMI8226细胞迁移率分别为（8.0±0.673）%及（4.82±0.186）%(P<0.01)，XG-7的细胞迁移率分别为（0.88±0.036）%、（0.58±0.020）%（P<0.05）。5）18α-GA可抑制MM细胞在BMSCs的粘附，其作用前后RPMI8226细胞粘附率分别为（16.967±1.55）%、（11.1±0.819）%（P<0.05），XG-7的细胞粘附率分别为（9.5±1.323）%、（6.63±0.551）%（P<0.05）。结论：BMSCs及部分MM细胞表达Cx43,MM-MSCCx43表达高于ND-MSC。阻断间隙连接可抑制BMSCs诱导的MM细胞的迁移和粘附，并可抑制BMSCs的SDF-1α分泌。第二部分三维BMSCs细胞球的建立及其特点观察目的：建立BMSCs的三维培养方法以模拟骨髓微环境，并观察MM细胞在三维培养的BMSCs细胞球中的迁移。方法：在琼脂糖包被的圆底培养板中进行BMSCs的三维培养，倒置显微镜、HE染色及电镜下观察三维培养的BMSCs（3D-BMSCs）的形态特点，RT-PCR检测3D-BMSCs和普通二维培养的BMSCs（2D-BMSCs）的Cx43mRNA、SDF-1αmRNA的表达。免疫荧光检测18α-GA对RPMI8226细胞在3D-BMSCs细胞球中迁移的影响。结果：BMSCs在琼脂糖包被的圆底培养板中可呈球形生长，4天后细胞球直径约450μm。细胞球石蜡切片HE染色示，细胞球外层多为长梭形细胞，内部为多角形、不规则细胞。扫描电镜示，BMSCs细胞及其胞外丝状突起、基质样物质形成细胞球的外层结构，外层BMSCs仍为长梭形。与2D-BMSCs相比，3D-BMSCs的SDF-1αmRNA表达明显升高，Cx43mRNA表达无明显差别；18α-GA可抑制RPMI8226细胞在3D-BMSCs细胞球中的迁移。结论：3D-BMSCs细胞球在一定程度上可模拟骨髓微环境，其SDF-1αmRNA表达较2D-BMSCs明显升高，并且其Cx43表达对诱导MM细胞的迁移有重要作用。第三部分MM细胞与BMSCs共培养体系中Cx43表达变化及其生物学效应目的：观察MM细胞与BMSCs共培养体系中Cx43表达水平的变化及其对MM细胞及BMSCs生物学行为的影响。方法：建立RPMI8226细胞和BMSCs的间接及直接共培养体系，用CD138磁珠分离直接共培养的RPMI8226细胞及BMSCs。实时定量PCR、Westernblot检测共培养前后BMSCs的Cx43表达，免疫荧光法检测Cx43分布；划痕实验检测共培养后BMSCs间隙连接通讯（GJIC）的变化；ELISA检测共培养前后BMSCsSDF-1α分泌水平变化。Westernblot检测共培养前后BMSCs的beclin、LAMP、LC3表达及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对共培养体系中BMSCsLC3及Cx43表达的影响。Vonkossa染色检测RPMI8226细胞和3-MA对BMSCs成骨分化的影响。结果：1）直接或间接共培养后BMSCs的Cx43mRNA相对表达量明显提高，分别是单独培养时的1.36倍和2.1倍。2）Westernblot检测示共培养后BMSCsCx43蛋白表达水平也上调，免疫荧光示增高的Cx43主要分布在胞质。3）划痕实验显示在BMSCs与RPMI8226直接共培养后荧光染料在细胞间扩散距离增加。4）与BMSCs直接共培养后，RPMI8226细胞Cx43表达降低，间接共培养后Cx43表达无明显变化。5）在BMSCs与RPMI8226细胞直接和间接共培养体系中，BMSCs培养上清SDF-1α水平分别为（373.02±10.11）和（309.71±10.71）pg/ml，均高于共培养前（237.84±9.23）pg/ml（P<0.01，P<0.05）。经18α-GA作用后，直接和间接共培养体系中SDF-1α分别降为（126.01±4.80）（P<0.001）和（106.99±3.39）pg/ml（P<0.01）。6）RPMI8226与BMSCs共培养48h后，BMSCs的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、beclin均较对照组升高，溶酶体相关蛋白LAMP1也升高。3-MA抑制共培养体系中BMSCs的自噬水平，同时BMSCs的Cx43水平较前升高。RPMI8226细胞可抑制BMSCs的成骨分化，3-MA可减轻该抑制作用。结论：MM细胞可通过上调BMSCsCx43的表达并增强BMSCs的GJIC，从而促进BMSCsSDF-1α的分泌。MM细胞可通过上调BMSCs的自噬水平抑制BMSCs的成骨分化。
【作者】张晓慧；
【导师】傅晋翔；
【作者基本信息】苏州大学，内科学血液病，2014，博士
【关键词】多发性骨髓瘤；骨髓间充质干细胞；间隙连接蛋白43；基质细胞衍生因子-1α；细胞迁移；细胞粘附；三维立体培养；自噬；成骨分化；

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