血小板裂解液复合脂肪来源干细胞促进腱骨愈合的实验研究

【摘要】第一部分血小板裂解液对无血清培养基中脂肪来源干细胞增殖的影响目的：研究血小板裂解液替代胎牛血清对脂肪来源干细胞（ADSC）分离、增殖、免疫表型的影响，为临床个体化应用PL进行损伤修复提供实验依据。方法：根据二次离心法制作血小板血浆（PRP），然后通过冻融法制作血小板裂解液（PL）。进行ADSC的分离、培养，测定其免疫表型，使用CCK-8法测定10%PL组培养、5%PL组培养、10%FBS组培养对细胞增殖活性的影响。结果：对大鼠血液的二次离心法可以制备出六倍于基础血小板浓度的PRP，在对大鼠ADSC进行培养时，其免疫表型没有发生突变，CCK-8结论为10%PL在培养4天时ADSC增殖活性显著高于10%FBS，结论：PL用于培养ADSC时安全性好，可以在无血清培养基中应用；10%PL培养ADSC时，具有显著促进增殖的优点，而ADSC的免疫表型没有因为PL的存在而发现突变。第二部分血小板裂解液对脂肪来源干细胞迁移及成软骨分化的影响目的：评估血小板裂解液对ADSC迁移的影响，验证PL在体外对ADSC的募集作用。研究PL在ADSC成软骨分化时的作用，为将来体内应用ADSC促进腱骨愈合提供实验室依据。方法：使用Transwell法对各种浓度的PL进行迁移实验，10%FBS作为对照组，然后分三组：空白对照组，TGFB3组，PL+TGFB3组分别进行ADSC的成软骨诱导培养。使用阿里新蓝染色测定检测细胞分泌的蛋白聚糖含量，同时行II型胶原免疫荧光检测确定其表达，在各个时间段行qPCR检测II型胶原mRNA表达，在4w时行OCN的mRNA表达。结果：在48h后，可见各浓度PL组有数量不一的ADSC附着与Transwell纤维膜，5%PL组细胞迁移能力显著大于其它各组。成软骨诱导后阿里新蓝染色见PL+TGFB3组和TGFB3组均匀蓝染，II型胶原免疫组化提示2w及3w时对照组无染色，而TGFB3组在2w及3w时均有II型胶原染色，PL+TGFB3组在2w和3w时染色丰富。qPCR检测提示对照组与TGFB3或者TGFB3+5%PL相比，mRNA表达量要小，2w，3w，4w的P值小于0.001，有统计学差异。TGFB诱导与TGFB3+5%PL诱导，2w时P<0.05，3w时P<0.001，4w时P<0.01，均有统计学差异，后者mRNA表达量大于TGFB3诱导组。OCN的mRNA无统计学差异。结论：PL对ADSC的促进迁移作用有浓度依赖，5%PL对ADSC具有较强的促迁移作用，特定环境下能促进软骨定向分化，其作用优于单纯使用TGFB3，且不会发生成骨分化。第三部分血小板裂解液复合脂肪来源干细胞对大鼠跟腱腱骨愈合界面的影响目的：探讨5%PL复合ADSC对腱骨结合处的愈合影响，观察其是否能促进纤维软骨形成，从而从组织学以及生物力学方面改善腱骨愈合质量。方法：建立大鼠跟腱腱骨愈合模型，清理跟腱止点后分三组，假手术组（G1），ADSC组（G2），ADSC+%PL组（G3），分别进行治疗。然后使用HE染色、Masson染色以及阿利新蓝染色进行组织学观察，在2w、4w、6w时分别提取腱骨组织，进行qPCR检测II型胶原含量。并在2w、4w、6w时测定生物力学变化。结果：HE染色见G1组6w时止点处为Sharpy纤维，而G2组6w时形成潮线，G3组4w时有潮线形成，6w时可见典型四层结构止点。Masson染色见6w时G1组纤维组织疏松紊乱，胶原纤维波浪样,杂乱排列。G2组纤维组织排列较好，胶原纤维边界清晰。而G3组胶原纤维整齐排列，钙化软骨与纤维软骨结合紧密。行阿利新蓝染色，G1组6w可见止点愈合，软骨细胞周围有蓝染，钙化软骨处有钙质沉积，G2组可见软骨周围蓝染较多，软骨细胞椭圆形，而G3组软骨细胞周围蓝染较深，说明蛋白聚糖含量丰富。各图像蓝染值统计学分析示G3显著高于其它两组。qPCR检测在各时间段，G1组II型胶原mRNA表达量均显著小于G2组和G3组，在2w时G2组II型胶原mRNA表达量与G3组相似，但是4w和6w时均显著小于G3组。生物力学检测2w时G1组的最大拉力载荷最低，与正常腱骨组织相比有显著性差异，而同时G2组和G3组比G1显著增加。但此时G2组和G3组的最大拉力载荷与正常腱骨组织相比均显著下降。各组的最大拉力载荷随时间而增加。6w时G2和G3组的最大拉力载荷显著大于G1。同时在6w时，G3组的最大拉力载荷显著大于正常腱骨组织。结论：PL复合ADSC时，促进ADSC向软骨细胞分化，同时促进周围干细胞迁移，促进腱骨愈合，改善愈合质量，获得较好的生物力学性能。
【作者】茅泳涛；
【导师】董启榕；
【作者基本信息】苏州大学，外科学，2014，博士
【关键词】富血小板血浆；血小板裂解液；脂肪来源干细胞；无血清培养基；成软骨分化；qPCR；腱骨愈合；

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