SDF-1/CXCR4轴以及MCP-1/CCR2轴对小鼠骨髓间充质干细胞迁移及归巢的影响

【摘要】研究背景和目的缺血性心脏病系威胁人类健康的主要疾病之一,其发病率仍在不断上升,仍然是目前临床上充血性心衰病人的主要病因之一。传统认为心肌细胞属于终末期分化细胞,一旦损伤坏死则不能再生。尽管新近有实验提出成人心肌细胞本身可能具有分裂增殖的能力,但其分裂指数仅为0.03%-0.9%[1-3]；也有实验[4,5]提出心肌中存在的心肌干／祖细胞(cardiacstem/progenitorcells,CSCs/CPCs)可以分化为成熟心肌细胞,但由于其数量极为有限,不能在心肌梗死后产生足够的新生心肌取代梗死之心肌,最终心肌梗死病人的梗死心肌纤维化,并绝大部分由疤痕组织替代,丧失心脏作为血泵的收缩功能,纤维化的心肌对剩余的健康心肌也产生严重影响,随之而来的心室重构进一步影响心脏功能,最终发展为终末期心脏病和充血性心衰。虽然心脏移植是目前治疗终末期心脏病病人最为有效的方法,但由于供体心脏来源严重短缺,加上各种免疫抑制剂的副作用给人体带来的不良影响,严重限制了心脏移植的广泛开展和应用。心脏辅助装置的应用可以使部分病人得到短时的改善,但常常只能作为等待心脏移植的过渡手段,而不能达到长期的治疗效果,加上其昂贵的医疗费用,难以在临床大规模使用和开展。目前对缺血性心脏病常用的治疗方法包括药物治疗、冠状动脉介入治疗和心脏冠状动脉搭桥等方法,均主要集中于改善心肌缺血,而对坏死心肌没有任何作用。因此,国际上一直在探索新的治疗方法。已有实验提示,干细胞可能分化为心肌细胞、促进梗死区血管新生,改善心脏功能。胚胎干细胞由于排斥反应及伦理问题,其研究、应用受到一定限制；而自体骨髓干细胞取材简单、易于增殖、移植后无免疫排斥反应,又不涉及伦理问题,正在成为国内外研究的热点。研究显示：骨髓干细胞具有复杂性、多能性和迁移性。成年骨髓细胞包括不同的成熟阶段,也包括原始阶段的骨髓干细胞或称之为多系祖细胞,以及骨髓基质和开始分化的各系定向祖细胞。骨髓干细胞没有一种具体的分化倾向,是一种具有多分化潜能及自我修复功能的早期未分化细胞,几乎可能转化成人体任何组织。骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是其中最具分化潜能的一组细胞,但MSCs也并非是完全纯化的细胞群体,而是由不同发育分化潜能的干细胞组成。近来已发现较多MSCs表面标记,而且不同成熟程度的MSCs表面标记并不完全相同,由此可见其复杂性。骨髓干细胞治疗缺血性心脏病主要涉及到心肌缺血后局部细胞因子的表达变化、细胞因子对移植或自身干细胞的趋化归巢作用以及干细胞归巢后的治疗作用。可供治疗选用的干细胞有多种亚型,包括造血干细胞、内皮祖细胞、间质干细胞、单个核细胞等,各种细胞亚型有其自身不同的特点。造血干细胞较其它细胞数量多,研究最为深入、透彻,但由于其分化范围狭窄,只能分化为造血系细胞,从而使其应用受到一定限制；内皮祖细胞可以分化为血管内皮细胞,促进血管新生,从而改善组织血液供应；间质干细胞具有多种分化潜能,可以分化为治疗所需要的各种目标细胞而发挥治疗作用,是很理想的移植细胞；而骨髓单个核细胞由于获取方便、不需培养、细胞种类丰富而获得部分研究者的青睐。但无论选用哪一种细胞都涉及到一个中心的问题：归巢。干细胞必须归巢到目标区域才能产生治疗作用。归巢一词起源于骨髓移植疗法的开展,其意义为经静脉输入的干细胞通过血液循环特定地植入到支持其生长发育的骨髓微环境中的过程。随着研究范围的扩展,目前归巢的意义已扩展为骨髓干细胞在特定条件的诱导下移行并定位于机体目标组织的过程。心肌梗死后梗死区域局部产生剧烈的炎症反应,生成多种细胞因子,包括SDF-1与MCP-1;Ma等[6]研究提示SDF-1于心肌梗死后早期升高,并能通过SDF-1/CXCR4轴促进移植的MSCs归巢到梗死心肌组织中；而Askari等[7]在重建梗死心肌中SDF-1的表达后,观察到G-CSF动员的骨髓干细胞归巢到了梗死心肌中。Lu等[8]研究发现SD大鼠心肌梗死3d后梗死心肌中MCP-1含量显著升高,于第7d达峰值；而Wang等[9]发现,44.6%的MSCs表达MCP-1的受体CCR2,并且可通过MCP-1与CCR2的结合促进MSCs归巢。这些研究均提示SDF-1、MCP-1在促进干细胞归巢中起到了一定的作用。归巢后的干细胞可能分化为心肌样细胞或分泌细胞因子促进血管新生、减少心肌细胞凋亡,从而改善心脏功能。内源性SDF-1及MCP-1可能数量有限,且表达时间过短,与心肌梗死后早期剧烈的炎症反应重叠,限制了其促使干细胞归巢并改善心脏功能的治疗作用；而有关外源性SDF-1及MCP-1促进干细胞归巢的研究很少。因此,有必要对外源性SDF-1及MCP-1在干细胞归巢中的作用进行研究。而且,多数研究的结果提示移植的干细胞未能归巢到最需要修复的梗死中心区域,而是植入到了梗死周边区域。这种现象是否与梗死后心肌不同部位归巢相关因子的表达存在差异有关尚不明确。MI后随着时间的推移,梗死心肌的修复重构也在不断进行,心肌重构导致梗死区变薄、膨出及心脏整体扩张,对心功能产生极为不利的影响。由于我国经济基础差,人民健康意识淡薄等原因,许多心肌梗死患者,尤其是广大农村的患者,对缺血性心脏病的认识不足,从而延误了疾病的治疗,使病情不断进展而发展为终末期心脏病,导致充血性心衰的发生。干细胞移植给广大患者带来了福音,而MI后应该何时给予干细胞移植及采用外源性细胞因子干预时究竟应该给多少剂量等均有待于进一步研究。基质细胞衍生因子-1α(Stromalcell-derivedfactor,SDF-1α)属于CXC族趋化因子成员,是生物体内一种关键的细胞趋化因子。CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)是SDF-1α的受体,表达于多种干／祖细胞表面,可与SDF-1α耦合介导其迁移。很多研究发现心肌缺血、血管内膜损伤可上调SDF-1α的表达,介导多种干细胞归巢新生血管、修复损伤内皮。SDF-1α参与心梗后骨髓间充质干细胞分化调控,可促进血管新生、减小心梗面积。但SDF-1α/CXCR4轴调控骨髓间充质干细胞归巢的作用及机制有待进一步研究。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)蛋白家族是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,广泛表达于多种组织与细胞中,参与细胞迁移、增殖、分化、凋亡血管生成和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。多项实验表明,P13K参与SDF-1α/CXCR4调控的骨髓基质干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞等多种干／祖细胞趋化作用及迁移。但PI3K/Akt的抑制剂wortmannin和ser磷酸化抑制剂LY294002可阻断这一效应,这一结果表明,P13K通路在骨髓间充质干细胞的迁移、归巢中发挥作用。通过实验证实,磁珠分选后的间充质干细胞表面表达有CXCR4/CCR2,它们与趋化因子的相互作用可通过激活P13K途径促进其他干／祖细胞迁移、归巢。本课题观察CXCR4/CCR2表达对小鼠骨髓间充质干细胞体外迁移和体内归巢的影响,同时探讨P13K通路是否参与CXCR4/CCR2介导的骨髓间充质干细胞迁移；采用磁珠分选CXCR4/CCR2日性细胞联合梗死周边注射小鼠骨髓间充质干细胞的方法,评价SDF-1/CXCR4轴和MCP-1/CCR2在骨髓间充质干细胞归巢及心肌再生中的作用,并探讨P13K通路在其中的作用。本研究成功培养了ICR小鼠的骨髓间充质干细胞,建立ICR小鼠心肌梗死模型,分选骨髓间充质干细胞中CXCR4和CCR2表达阳性的细胞,研究其归巢和迁移能力的差异,对小鼠梗死心肌修复的影响,并对PI3K/Akt通路在该归巢效应中的潜在作用进行了初步探讨。方法：1.无菌条件下取5-8周龄ICR小鼠的胫腓骨,体外全骨髓贴壁法培养,80%铺满后进行传代,流式鉴定细胞表面分子表达以及细胞周期,G0/G1期细胞量较多,CD44、CD90、CD105阳性率较高的细胞符合骨髓间充质干细胞特征。2.气管插管辅助3、4肋间开胸结扎冠状动脉下支的方法建立小鼠心梗模型,检测LVEF、FS、LVEDD等指标,鉴定小鼠模型是否构建成功。3.小鼠骨髓间充质干细胞体外培养扩增联合免疫磁珠分选(MACS)纯化CXCR4/CCR2阳性骨髓间充质干细胞,并作克隆培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞分选前后的细胞表面标志物的表达情况。4.采用Transwell模型检测CXCR4/CCR2对骨髓间充质干细胞迁移的影响及其可能机制。下室种植心肌细胞,上室为纯化的骨髓间充质干细胞。实验共分为四组,对照组,CXCR4+/CCR2+组,CXCR4+/CCR2-组,CXCR4-/CCR2+组,24h后5个高倍视野计数迁移的细胞。免疫荧光检测下室穿过细胞。5.左冠脉前降支(LAD)结扎建立小鼠心梗模型后,在梗死区周边选取5个位点注射分选后的细胞,观察移植骨髓间充质干细胞对体内归巢及对心梗修复的影响。实验共分为7组：假手术组(sham组)：开胸,不作冠脉前降支(LAD)结扎也不作干细胞移植；心梗组(MI组)：结扎LAD制造心梗,但不作其它处理；PBS对照组(empty组)：结扎LAD,梗死周边区注射PBS;CXCR4+/CCR2+组：结扎LAD,梗死周边区注射CXCR4+/CCR2+骨髓间充质干细胞,共选5个位点注射,每次注射30u1,细胞浓度2×106个/ml;CXCR4+/CCR2-组：结扎LAD,梗死周边区注射CXCR4+/CCR2-骨髓间充质干细胞,共选5个位点注射,细胞数量同上；CXCR4-/CCR2+组：结扎LAD,梗死周边区注射CXCR4-/CCR2+骨髓间充质干细胞,共选5个位点注射；CXCR4-/CCR2-组：结扎LAD,梗死周边区注射CXCR4+/CCR2+骨髓间充质干细胞,共选5个位点注射,3周后检测梗死周边进行干细胞注射的对照组和细胞组CM-dil标记的间充质干细胞向梗死区迁移的情况(n=5)。6.归巢到梗死区的骨髓间充质干细胞分化情况采用免疫荧光检测。检测从周边迁移到梗死区的CM-dil标记的骨髓间充质干细胞的数量,每个心脏标本,梗死区随机取10个高倍视野,计算CM-DIL阳性细胞的比例。7.检测PI3K/Akt通路在CXCR4/CCR2细胞迁移过程中的影响。在transwell小室模型中,下室加入MCP-1/SDF-1,LY组细胞均用LY294002孵育。本实验分12组：control组、CXCR4+/CCR2+组、CXCR4+/CCR2-组、CXCR4-/CCR2+组、control(MCP-1/SDF-1)组、CXCR4+/CCR2+(MCP-1/SDF-1)组、CXCR4+/CCR2-(MCP-1/SDF-1)组、CXCR4-/CCR2+(MCP-1/SDF-1)组control(MCP-1/SDF-1、LY)组、CXCR4+/CCR2+(MCP-1/SDF-1、LY)组、CXCR4+/CCR2-(MCP-1/SDF-1、LY)组、CXCR4-/CCR2+(MCP-1/SDF-1、LY)组。WesternBlot检测pAkt表达水平,各组WB条带的OD值与内参组的OD值的比值作为各组的pAkt表达强度,比较PI3K/Akt通路在CXCR4/CCR2细胞迁移中所起的作用。结果：1.全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞成功,CD44/CD90/CD105均高表达,G0/G1期细胞率高于70%。2.ICR小鼠心梗模型构建成功,与对照组比较,心梗4周后小鼠左室舒张末期内径(LVEDd)和左室收缩末期内径(LVEDs)明显增加(P<0.05),左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短指数(FS)明显降低(P<0.05)。二维图像见心梗模型组左室腔扩大,左室前壁出现节段性运动减弱、消失及反向运动等现象；梗死区局部有心肌强回声,室壁变薄。3.MACS分选获得纯度较高的CXCR4/CCR2阳性骨髓间充质干细胞,在体外可克隆扩增。流式结果表明,MACS分选前,混合细胞中CXCR4阳性细胞比例为31.09±0.35%,经c-kit免疫磁珠纯化后为86±4.51%,CCR2阳性细胞比例为16.52±0.76%,经c-kit免疫磁珠纯化后为56±6.37%,CXCR4/CCR2双阳性细胞比例分别为45.62±5.16%,说明磁珠分选干细胞成功。4.Transwell迁移实验表明,穿越小室的CXCR4和CCR2表达阳性的小鼠骨髓间充质干细胞数量明显较对照组多(248.67±9.29vs135.33±11.37,P=0.000<0.01,n=3)(图4-4和图4-5)。而CXCR4表达阳性的小鼠骨髓间充质干细胞数量与双阳性细胞组比较,明显少于后者(202.33±9.07vs248.67±9.29,P=0.02<0.05,n=3)。同样,CCR2表达阳性的小鼠骨髓间充质干细胞数量也明显少于双阳性细胞组(186.33±7.37vs248.67±9.29,P=0.002<0.01,n=3)。说明通过磁珠分选提高间充质干细胞表面趋化因子受体CXCR4/CCR2的表达可以促进骨髓间充质干细胞向靶位的迁移。5.CSCs体内归巢实验表明,以磁珠分选提高细胞表面趋化因子受体表达可以促进骨髓间充质干细胞向分泌趋化因子的心肌归巢(CXCR4+/CCR2+vscontrol,226.67±10.97vs123.33±10.26,P=0.003<0.01,n=3)(图4-8,图4-9)。而CXCR4表达阳性的小鼠骨髓间充质干细胞数量与双阳性细胞组比较,明显少于后者(199.0±10.54vs226.67±10.97,P=0.02<0.05,n=3)。同样,CCR2表达阳性的小鼠骨髓间充质干细胞数量也明显少于双阳性细胞组(112.0±14.0vs226.67±10.97,P<0.01,n=3),CXCR4阳性组细胞迁移数高于CCR2阳性组,且CCR2表达阳性的小鼠骨髓间充质干细胞数量与对照组相比差异不显著(112.0±14.0vs123.33±10.26,P=0.314>0.05,n=3)。体内归巢实验的结果与体外Transwell迁移实验的结果是一致的,再一次证实了磁珠分选获得表达不同趋化因子受体的间充质干细胞,因为SDF-1表达水平较高,SDF-1/CXCR4轴对于间充质干细胞迁移归巢的影响明显要强于MCP-1/CCR2轴。6.WB结果显示,通过QuantityONEV4.6.7软件以光密度积分值(IOD)对WesternBlot结果进行定量分析,结果显示,下室加入趋化因子后,未分选细胞、CXCR4+/CCR2+细胞、CXCR4+/CCR2-细胞、CXCR4-/CCR2+细胞的磷酸化Akt表达水平均上调,ser位点磷酸化抑制剂LY294002孵育细胞后pAkt表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：通过磁珠分选获得的CXCR4/CCR2阳性细胞注射心梗小鼠心肌,能有效促进小鼠心功能改善,缩小梗死面积,其效果优于未分选细胞,且CXCR4/CCR2阳性细胞的归巢能力都显著强于未分选细胞,其潜在机制可能与PI3K/Akt通路的活化相关。该研究为临床应用提供了一定的理论基础和实验依据。
【作者】王宜青；
【导师】沈振亚；
【作者基本信息】苏州大学，胸心血管外科学，2014，博士
【关键词】SDF-1/CXCR4轴MCP-1/CCR2轴；骨髓间充质干细胞；迁移；归巢；

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