细胞周期蛋白D1对人乳腺癌细胞药物敏感性的调控

【摘要】背景细胞周期蛋白D1(cyclinD1)是细胞周期启动和运转过程中一个必需的和至关重要的感应器和启动器，对细胞生长繁殖起到关键的调节作用;但是，过度的细胞周期蛋白D1表达是各种人类肿瘤，包括乳腺癌的一个共同的主要特征。研究证实，在某些类型的人类肿瘤中，过度的细胞周期蛋白D1表达与肿瘤的治疗和预后有一定关系。目标本课题意在研究人类乳腺癌中,细胞周期蛋白D1对肿瘤的演变和预后的影响；与肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的关系；以及在肿瘤的发展演变和对化疗药物反应的过程中，与细胞周期蛋白D1相互协调的其他细胞内信号通路。材料和方法利用人类乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB231作为工具细胞，利用真核细胞外源表达的病毒载体作为中介，构建了稳定表达野生型人类细胞周期蛋白D1或第112位氨基酸单个定点突变（K112E）的细胞周期蛋白D1变异蛋白；同时，相应的空载体表达细胞株作为对照。K112E定点变异的D1蛋白已被证实失去了细胞周期的启动和催化活性，虽然可与D1依赖性激酶CDK4/6结合但无法激活CDK4/6激酶。选用三种临床应用的抗肿瘤药物，顺铂(CDDP),五氟尿嘧啶(5-FU)和吉他西滨（Gemzar）检测不同细胞株和细胞克隆的敏感性。研究过程中，以稳定表达外源蛋白的细胞克隆为研究对象，通过细胞和分子生物学的一系列检测手段，包括四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测细胞生长;流式细胞技术（FACs）介导的经碘化丙啶（PI）染色后对细胞周期的分析;药物处理后存活细胞集落形成实验;吖啶橙/溴化乙锭(AO)/EB)双染色法鉴定药物引起的细胞凋亡;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测相应基因转录水平;蛋白质印迹法（Western-blot）检测相应蛋白的表达水平及药物引起的蛋白水平的改变。结果本课题主要分三个层次对细胞周期蛋白D1在乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性的调节作用进行了研究，取得的主要结果如下：一.利用四唑盐（MTT）实验检测常用的三种抗肿瘤药物，五氟尿嘧啶（5FU），顺铂（CDDP）和吉西他滨(Gemzar)对三种人类乳腺癌细胞，MCF7，MB231和MCF15细胞生长的抑制作用；或是同时使用细胞周期蛋白D1依赖性激酶CDK4抑制剂，NPCD，干扰CDK4的活性检测三种细胞对上述化疗药物反映的改变。我们初步得到结论，细胞周期蛋白D1对乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性具有调节作用。但是，细胞周期蛋白D1的作用是否需要其相应激酶的协调作用，以及作用的结果是促进还是抑制化疗药物的疗效，针对不同的药物，在不同细胞的反应是不同的。蛋白质印迹法实验结果显示，在完全相同的培养条件和实验条件下，上述三种细胞内的细胞周期蛋白D1及其依赖性激酶CDK4的水平存在差异，但是无法解释细胞对药物敏感性的差别。初步验证了我们的假设，即细胞周期蛋白D1本身或是结合其相应的激酶CDK4调节乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。二.利用真核细胞表达外源蛋白的反转录病毒系统为工具，在MCF7和MB231细胞中构建了稳定表达外源细胞周期蛋白D1的克隆并对其对化疗药物的敏感性进行了系统的检测，得到如下结果：1.在对MCF7细胞克隆的研究中得到如下结果：构建了稳定表达野生态及定点突变的外源细胞周期蛋白D1的细胞克隆（D1和D1KE）及相应的空载体对照克隆，RT-PCR和蛋白质印迹法实验结果证实了外源蛋白的表达。1)MTT实验，AO/EB双染色法及平板细胞集落形成实验的结果均证实，MCF7细胞D1克隆对于CDK4激酶抑制剂NPCD，顺铂（CDDP）和吉西他滨(Gemzar)三种药物的敏感性强于D1KE克隆和空载体克隆。而且D1和D1KE克隆在药物作用终止后，恢复生长繁殖的能力低于空载体克隆。由此，在MCF7乳腺癌细胞中表达外源D1蛋白增强了细胞对抗肿瘤药物的敏感性，在某种程度上，D1的作用需要CDK4激酶的活性的协调，但是对CDK4激酶的依赖性和依赖程度与抗肿瘤药物的作用特点相关。2)通过对三种克隆细胞周期的分析显示，在无血清或5%FBS培养条件下，三种克隆之间细胞周期的分布无显著差异。由此证实，三种克隆之间对药物敏感性的差异并不是由于加速的细胞生长而引起的，而外源表达的D1没有引起细胞的加速繁殖。3)MCF7表达外源D1或D1KE蛋白增强了细胞在软琼脂培养基中生长和集落形成的能力，并且D1KE克隆显著强于D1克隆，表明这是D1蛋白不依赖CDK4激酶活性的一种功能，与肿瘤的细胞的转移和迁徙相关。2.在对MB231细胞克隆的研究中得到如下结果：1)成功构建了稳定表达野生态及定点突变的外源细胞周期蛋白D1的细胞克隆（D1和D1KE）及相应的空载体对照克隆，RT-PCR和蛋白质印迹法实验结果证实了外源蛋白的表达。2)MTT实验，AO/EB双染色实验方法及平板细胞集落形成实验的结果均证实，MB231细胞D1和D1KE克隆对于顺铂和吉西他滨均表现出强于空载体克隆的耐受性。对于CDK4激酶抑制剂NPCD的作用，D1克隆比空载体克隆和D1KE克隆更敏感。对于吉西他滨的作用，D1KE克隆表现出最强的耐受性，因而，很可能是CDK4的活性抑制D1在此信号反应中的作用。3)对于三种克隆在无血清及5%FBS培养条件下的细胞周期分析的结果并未发现显著差异。由此我们认为，三种克隆之间对药物敏感性的差异并非是由于表达外源D1蛋白而加速了细胞生长而引起的。同时，血清表现出对MB231乳腺癌细胞的生长反向调节作用。4)MB231表达外源D1或K112E突变的D1蛋白增强了细胞在软琼脂培养基中生长和集落形成的能力，并且D1KE克隆显著强于D1克隆，表明这是D1蛋白不依赖CDK4激酶活性的一种功能，提示了肿瘤细胞增强的迁徙和转移的能力。三.吉西他滨是临床用于治疗多种恶性肿瘤的一类常用的抗肿瘤药物，前面的实验结果已经证实对MCF7和MB231乳腺癌细胞均有较强的细胞毒作用，并且，在细胞表达外源D1或D1KE蛋白的状态下表现出对吉西他滨的敏感性的改变。因而，我们进一步研究了给予吉西他滨处理后，MCF7和MB231细胞克隆的反应，以及D1,D1KE和空载体克隆之间的特异性，对D1在此反应中的作用和作用机理进行了进一步的追踪。所得到的研究结果如下：1.吉西他滨引起的MCF7细胞克隆的反应及特点：1)给予1M的吉西他滨作用24小时后，RT-PCR检测细胞周期相关基因的表达提示，内源性的D1基因转录受到抑制，其他细胞周期相关基因的转录无明显变化。但是，与肿瘤的发生发展相关的cMYC和P53基因的转录在吉西他滨作用下出现变化且在三种克隆之间的有显著差异。2)给予1M的吉西他滨作用24小时后，蛋白质印迹实验结果提示，D1蛋白的水平在D1及D1KE克隆均略微减低，而在空载体克隆增高。可见，吉西他滨可以影响MCF7细胞D1蛋白水平的改变。同时，吉西他滨引起一些细胞周期相关性蛋白表达上调，包括，CDK4，CDK6,CDK2,cyclinE和P53蛋白，但是三种克隆之间上调的程度不同且缺乏一定的特征性。我们并未检测到与细胞存活相关的蛋白的表达受到吉西他滨的影响。3)吉西他滨作用48小时对MCF7细胞三种克隆的细胞周期均无明显的影响。2.吉西他滨引起的MB231细胞克隆的反应及特点：1)给予1M的吉西他滨作用24及48小时后，RT-PCR检测细胞周期相关基因的表达包括D1,CDK4，CDK2，CCNE,P21,P27,P53和c-Myc基因，均无显著的变化。2)蛋白质印迹实验结果提示，给予1M的吉西他滨作用24或48小时，药物引起D1蛋白的水平在D1及D1KE克隆均明显的降低，而且48小时降低较24小时更明显。但是，在空载体克隆，D1蛋白未显示出药物引起的明显改变。其他与细胞周期相关蛋白的表达无明显的改变，只有cMYC蛋白在空载体克隆和D1克隆中明显降低。在三种克隆中吉西他滨均引起细胞凋亡的标志蛋白，pPARP蛋白的明显增多，而且以空载体克隆最明显。也同时引起细胞存活能力的标志蛋白，Bcl-2不同程度的增多，且D1和D1KE克隆增高水平较于空载体克隆明显。3)吉西他滨处理48小时后细胞周期的分析发现，MB231细胞三个克隆之间，D1KE克隆较空载体克隆和D1克隆表现出G1期的显著增多和S期的相应减少。吉西他滨在三种克隆中引起不同程度的G1期缩短。结论1.细胞周期蛋白D1在人类乳腺癌细胞对抗肿瘤药物的反应中起到一定的调节作用。2.细胞周期蛋白D1在调节MCF7和MB231乳腺癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性中的作用与其在传统的细胞周期中结合并激活CDK4/6激酶起到感应和启动作用是相互独立的信号通路。3.细胞周期蛋白D1在肿瘤细胞对抗肿瘤药物细胞毒性作用的反应中的调节作用是依细胞类别，细胞本身的信号通路特点及药物的作用靶点和药物作用机理密切相关，相互影响。
【作者】孙源；
【导师】罗殿中；
【作者基本信息】广西医科大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】乳腺癌；细胞周期激酶4/6；肿瘤化疗敏感性；细胞周期蛋白D1；核转录因子(NFκB)；肿瘤生长因子-β；

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