红霉素联合地塞米松对烟草烟雾暴露下单核细胞炎症作用的影响及机制研究

【摘要】目的观察红霉素联合地塞米松对慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血单个核细胞炎症作用的影响。方法入选吸烟的COPD患者及无吸烟史的健康志愿者各10例，抽取适量外周血，在无菌条件下应用泛影钠不连续密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞（PBMCs）。健康志愿者PBMCs设为正常对照组，COPD患者的PBMCs又分为COPD组，红霉素组及联合治疗组（红霉素+地塞米松）。红霉素组给予红霉素（10μg/ml）预孵育2小时，再给予不同浓度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小时后予TNF-α刺激过夜；健康对照组及COPD组应用培养基代替红霉素；红霉素联合激素组的PBMCs给予红霉素及地塞米松（10-6mol/L）预孵育2小时，再给予不同浓度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小时后予TNF-α刺激过夜。经培养后，应用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞培养上清液中白细胞介素（Interleukin，IL）-8的水平，根据不同浓度地塞米松对应的IL-8抑制率绘制半对数曲线，应用MicrosoftExcel2003计算IL-8抑制率及地塞米松半数抑制浓度（IC50-Dex），应用SPSS16.0统计学软件完善统计学分析。结果（1）地塞米松在10-10-10-6的浓度时，COPD组的IL-8抑制率（10-6：51.10±3.02%，10-7：50.08±3.30%，10-8：50.20±2.55%，10-9：46.80±2.38%，10-10：25.50±3.00%）明显低于健康对照组（77.08±2.80%，76.51±3.52%，73.60±3.52%，68.30±3.02%，50.51±2.43%），均P<0.05；COPD组IC50-Dex为54.9±2.2nmol/μL，明显高于健康对照组（0.20±0.08nmol/μL），P<0.05。（2）地塞米松在10-10-10-6的浓度时，红霉素组的IL-8抑制率（10-6：55.82±3.11%，10-7：52.23±3.31%，10-8：51.68±2.43%，10-9：48.92±2.29%，10-10：29.98±3.07%）以及联合治疗组IL-8抑制率（70.88±4.29%，69.52±3.22%，66.18±2.60%，62.28±2.62%，42.53±2.46%）均明显高于COPD组，其中联合治疗组对IL-8的抑制较红霉素组更加明显，均P<0.05。红霉素组IC50-Dex（5.67±1.15nmol/μL）及联合治疗组IC50-Dex（1.03±0.06nmol/μL）明显低于COPD组，其中联合治疗组较红霉素组更加显著，均P<0.05。结论（1）吸烟的COPD患者IC50-Dex升高，提示存在糖皮质激素抵抗；（2）红霉素及联合地塞米松的IC50-Dex低于COPD组，IL-8的释放减少，表明红霉素联合地塞米松能够减轻糖皮质激素抵抗，增加抗炎效果，联合治疗较单独应用红霉素更加显著。目的观察红霉素联合地塞米松对烟草烟雾暴露下人单核细胞炎症作用的影响。方法以U937细胞株为研究对象，分为：对照组，烟草烟雾提取物（CSE）组，红霉素组及联合治疗组（红霉素+地塞米松）。红霉素组的细胞给予红霉素（10μg/ml）预孵育2小时后给予CSE刺激过夜，之后给予不同浓度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小时后予TNF-α刺激过夜；CSE组应用培养基代替红霉素，其余干预措施同红霉素组；对照组仅给予不同浓度激素及TNF-α，红霉素及CSE均由培养基代替；联合治疗组的细胞给予红霉素及地塞米松（10-6mol/L）预孵育2小时后给予CSE刺激过夜，之后给予不同浓度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小时后予TNF-α刺激过夜。经培养后，应用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞培养上清液中白细胞介素（Interleukin，IL）-8的水平，根据不同浓度地塞米松对应的IL-8抑制率绘制半对数曲线，应用MicrosoftExcel2003计算IL-8抑制率及地塞米松半数抑制浓度（IC50-Dex）。应用SPSS16.0统计学软件完善统计学分析。结果（1）地塞米松在10-10-10-6的浓度时，CSE组的IL-8抑制率（10-6：44.79±3.32%，10-7：42.44±3.50%，10-8：39.25±2.60%，10-9：35.20±2.40%，10-10：14.92±3.18%）明显低于对照组（61.05±3.15%，60.78±3.70%，59.12±2.37%，55.20±2.52%，37.71±3.43%），CSE组的IC50-Dex为762.90±66.85nmol/μL，明显高于对照组（5.72±1.10nmol/μL），均P<0.05。（2）地塞米松在10-10-10-6的浓度时，红霉素组的IL-8抑制率（10-6：55.59±3.26%，10-7：53.66±3.11%，10-8：50.85±2.55%，10-9：45.49±2.82%，10-10：29.54±2.66%）及联合治疗组的IL-8抑制率（49.93±3.36%，48.26±3.51%，45.28±2.63%，40.03±2.39%，22.05±3.16%）高于CSE组，其中联合治疗组对IL-8的抑制较红霉素组更加明显，均P<0.05。红霉素组IC50-Dex（112.57±17.88nmol/μL）及联合治疗组（24.36±7.28nmol/μL）明显低于COPD组，其中联合治疗组较红霉素组更加显著，均P<0.05。结论（1）CSE组的IC50-Dex升高，提示烟草烟雾暴露下的人单核细胞存在糖皮质激素抵抗；（2）红霉素及联合地塞米松的IC50-Dex低于CSE组，IL-8的释放减少，表明红霉素及联合地塞米松能够减轻糖皮质激素抵抗，增加抗炎效果，联合治疗较单独红霉素更加显著。目的观察红霉素联合地塞米松是否通过抑制PI3K-δ/Akt传导通路及增加HDAC2蛋白的表达而减轻烟草烟雾暴露下人单胞细胞的糖皮质激素抵抗，增加抗炎效果。方法以U937细胞株为研究对象，主要分为两部分进行观察研究：（1）首先观察抑制剂是否能够减轻糖皮质激素抵抗：将培养的U937细胞分为对照组，CSE组及抑制剂组。抑制剂组的细胞给予PI3K-δ抑制剂（IC87114:1μM）预孵育2小时后给予CSE刺激过夜，之后给予不同浓度的地塞米松（10-6-10-12mol/L）孵育1小时后予TNF-α刺激过夜；CSE组应用培养基代替IC87114，其余干预措施同红霉素组；对照组患者仅给予不同浓度激素及TNF-α，红霉素及CSE均由培养基代替。经培养后，应用ELISA检测白细胞介素（IL-8）的水平，根据不同浓度地塞米松对应的IL-8抑制率绘制半对数曲线，计算IL-8抑制率及地塞米松半数抑制浓度（IC50-Dex）；（2）进一步观察红霉素及联合地塞米松减轻烟草烟雾下单核细胞炎症反应的机制：将培养的U937细胞分为对照组，CSE组，地塞米松组，红霉素组，联合治疗组及抑制剂组。红霉素组的细胞给予红霉素（10μg/ml）预孵育2小时后给予CSE刺激过夜，再给予TNF-α刺激过夜；CSE组应用培养液代替红霉素，其他干预措施同红霉素组；抑制剂组的细胞给予IC87114（1μM）预孵育2小时后给予CSE刺激过夜，再给予TNF-α刺激过夜；Dex组的细胞给予地塞米松（10-6mol/L）预孵育2小时后给予CSE刺激过夜，再予TNF-α刺激过夜；红霉素联合激素组的细胞给予红霉素及地塞米松预孵育2小时后给予CSE刺激过夜，之后再予TNF-α刺激过夜；对照组只给予TNF-α刺激，其余干预措施均由培养液代替。经以上培养干预后，应用Westernblotting检测各组细胞内组蛋白去乙酰化酶II（HDAC2），PAkt及Akt的表达；应用RT-PCR检测各组细胞HDAC2mRNA的表达；应用HDAC活性检测试剂盒检测总HDAC活性；应用SPSS16.0统计学软件完善统计学分析。结果（1）地塞米松在10-10-10-6的浓度时，CSE组的IL-8抑制率（10-6：44.79±3.32%，10-7：42.44±3.50%，10-8：39.25±2.60%，10-9：35.20±2.40%，10-10：14.92±3.18%）明显低于对照组（61.05±3.15%，60.78±3.70%，59.12±2.37%，55.20±2.52%，37.71±3.43%）及抑制剂组（56.70±2.82%，54.45±2.67%，52.96±2.33%，46.82±3.02%，30.14±2.86%），P<0.05。（2）CSE组的IC50-Dex为762.9±66.8nmol/μL，明显高于对照组（5.7±1.1nmol/μL）及抑制剂组（14.1±3.8nmol/μL），P<0.05。（3）CSE组的HDAC2蛋白表达明显低于空白对照组，红霉素组及联合治疗组，其中联合治疗组HDAC2蛋白的表达明显高于红霉素组，均P<0.05；作为阳性对照，抑制剂组的HDAC2蛋白表达亦明显高于CSE组，P<0.05，Dex组及CSE组相比无统计学差异，P>0.05。（4）CSE组的HDAC2mRNA明显低于空白对照组，红霉素组及联合治疗组，其中联合治疗组HDAC2mRNA明显高于红霉素组，均P<0.05；作为阳性对照，抑制剂组的HDAC2mRNA表达亦明显高于CSE组，P<0.05；Dex组及CSE组相比无统计学差异，P>0.05。（5）CSE组的总HDAC活性明显低于红霉素组、联合治疗组及抑制剂组，P<0.05；红霉素组、联合治疗组及抑制剂组相比无统计学差异，P>0.05；CSE组与Dex组相比无统计学差异，P>0.05。（6）CSE组的PAkt表达明显高于红霉素组及联合治疗组，其中联合治疗组明显高于红霉素组，均P<0.05；作为阳性对照，IC87114同样能减少PAkt的表达，P<0.05；CSE组与Dex组相比无统计学差异，P>0.05。（7）各组总Akt表达无统计学差异，P>0.05。结论（1）PI3K-δ抑制剂组的IC50-Dex低于CSE组，说明PI3K-δ抑制剂可减轻糖皮质激素抵抗；（2）红霉素联合地塞米松可增加烟草烟雾暴露下人单核细胞HDAC2的表达，减少PAkt的表达，较单独红霉素更加明显。因此，红霉素联合地塞米松通过抑制PI3K-δ/Akt途径及增加HDAC2蛋白的表达减轻烟草烟雾暴露下人单核细胞的糖皮质激素抵抗，增加抗炎效果，较单独红霉素更加显著。
【作者】孙雪皎；
【导师】钟小宁；
【作者基本信息】广西医科大学，呼吸内科学，2014，博士
【关键词】慢性阻塞性肺疾病；外周血单个核细胞；炎症；白细胞介素-8；红霉素；烟草烟雾提取物；单核细胞；PI3K-δ/Akt通路；组蛋白去乙酰化酶II；

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