脊柱结核患者椎间盘MMPs和ADAMTS-4基因表达以及与其临床资料的关联研究

【摘要】1背景与目的我国脊柱结核发病率占全身骨、关节结核病发病率的首位。家庭经济贫困、自身营养不良、HIV病毒感染以及结核菌耐药性等多种因素加速了脊柱结核的传播。脊柱结核容易导致患者发生脊柱后凸畸形和下肢截瘫等严重并发症。在脊柱结核发病早期，感染常发生于椎体前部，但伴随疾病的发展，感染往往向前纵韧带方向播散，最终导致邻近多个椎体都发生结核破坏。当相邻椎体均受到结核破坏时，椎间盘也将受到破坏，发生变性坏死。虽然椎间盘发生破坏是脊柱结核疾病的一个重要疾病特征，但是关于结核菌破坏椎间盘的发生机制却鲜少报道。近期研究发现基质金属蛋白酶(matrixmetal—loproteinases，MMPs)和含I型血小板结合蛋白基序(TSP)的解聚蛋白样金属蛋白酶(adisintegrinlikeandmetalloproteinasewiththrombospondintype1motifs，ADAMTS)在细胞外基质破坏中发挥重要作用。MMPs是一类含有Zn2+的蛋白酶家族，由于其具有分解细胞外基质成分的功能，在人体生理性组织重构和免疫调节中发挥重要作用。含I型血小板结合蛋白基序(TSP)的解聚蛋白样金属蛋白酶(adisintegrinlikeandmetalloproteinasewiththrombospondintype1motifs，ADAMTS)是一类Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶，而其中的ADAMTS-4是一种软骨基质聚集蛋白聚糖（aggrecan）的降解酶。ADAMTS-4对于关节软骨中含有的大量aggrecan具有降解作用，导致关节软骨的抗压力和张力等物理属性下降。由于在脊柱结核患者椎间盘的破坏过程中，椎间盘软骨基质也发生破坏，根据理论推测ADAMTS-4参与了脊柱结核椎间盘的破坏。本研究分析ADAMTS-4，MMP-3,MMP-8,MMP-9,MMP-13,MMP-14基因在结核性椎间盘组织、退行性椎间盘组织和正常椎间盘组织内的表达情况以及差异性，通过Spearman秩相关分析MMPs表达的配对相关性，研究阐明脊柱结核患者椎间盘损害的发生机制，为治疗脊柱结核提供一定的理论依据。本次研究还通过详细调查各个脊柱结核患者的临床资料，结合MMPs和ADAMTS-4基因表达数据，分析研究各项基因表达指标与脊柱结核临床资料之间的相关性，为综合全面的治疗脊柱结核疾病提供理论基础。2方法2.1脊柱结核组（TBgroup）：60例结核椎间盘组织标本取自广西医科大学第一附属医院2011年3月1日至2012年4月30日在脊柱骨病外科接受手术治疗的脊柱结核患者。椎间盘突出组（IDgroup）：60例退行性椎间盘组织标本取自广西医科大学第一附属医院2011年3月1日至2012年4月30日在脊柱骨病外科接受手术治疗的椎间盘突出患者。正常组（controlgroup）：60例正常椎间盘组织标本取自广西医科大学第一附属医院2011年3月1日至2012年4月30日在脊柱骨病外科接受手术治疗的外伤性脊柱骨折患者。实验样本获得以后，由两名经验丰富的病理学家对组织标本进行检查，确保样本的准确性。所有样本由外科手术获得后，立即放入-80℃液氮中冷冻并保存直至进行组织RNA提取。2.2采用组织RNA提取技术和实时荧光定量PCR（RealtimefluorescentquantitativePCR,RT-PCR）技术，研究分析ADAMTS-4，MMP-3,-8,-9,-13,-14的mRNA转录水平在结核性椎间盘组织、退行性椎间盘组织和正常椎间盘组织内的表达情况以及差异性。通过Spearman秩相关分析MMPs表达的配对相关性。2.3采用临床问卷调查与实验室检查相结合的方式进行相关资料的采集。本次研究选取三组人员的临床资料包括：年龄，性别，职业，吸烟习惯，疼痛强度（视觉模拟量表评分，VAS），患病的脊柱节段，症状持续时间，C-反应蛋白（CRP）和血沉水平（ESR）。结合MMPs和ADAMTS-4基因表达数据，分析研究各项基因表达指标与脊柱结核临床资料之间的相关性。3结果3.1RT-PCR结果显示，脊柱结核组和椎间盘突出组的ADAMTS-4表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的ADAMTS-4表达虽然比椎间盘突出组高，但差异无统计学意义。脊柱结核组和椎间盘突出组的MMP-3表达增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-3表达虽然比椎间盘突出组高，但差异也无统计学意义。脊柱结核组的MMP-8表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-8表达比椎间盘突出组高，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-9表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-9表达比椎间盘突出组高，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组和椎间盘突出组的MMP-13表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-13表达比椎间盘突出组高，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组和椎间盘突出组的MMP-14表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-14表达比椎间盘突出组高，但差异无统计学意义。3.2研究数据表明，疾病越严重的脊柱结核患者的MMPs表达水平越高。中重度脊柱结核患者的MMP-3，-8，-9，-14表达水平显著增大(P<0.05)。轻中重度脊柱结核患者的MMP-13的表达水平均显著增大(P<0.05)。3.3脊柱结核组和椎间盘突出组的MMPs表达具有多重正相关性。具体而言，脊柱结核组的MMP-13表达水平与MMP-8，-9有显著的正相关性。此外脊柱结核组的MMP-8，-9表达水平之间也存在显著的正相关性。3.4脊柱结核组和椎间盘突出组：ADAMTS-4基因表达与患者的年龄、性别、职业、吸烟习惯、疼痛强度、患病的脊柱节段、症状持续时间、C-反应蛋白和血沉水平均无相关性(P＞0.05)。脊柱结核组：MMP-3基因表达与吸烟习惯有正相关性(P=0.007)。MMP-3基因表达与患者的年龄、性别、职业、疼痛强度、患病的脊柱节段、症状持续时间、C-反应蛋白和血沉水平均无相关性(P＞0.05)。脊柱结核组：MMP-8基因表达与年龄(P=0.011)、疼痛强度(P=0.014)、C-反应蛋白(P=0.004)和血沉水平(P=0.002)有正相关性。MMP-8基因表达与患者的性别、职业、患病的脊柱节段、症状持续时间等无相关性(P＞0.05)。椎间盘突出组：MMP-8基因表达与年龄(P=0.032)、C-反应蛋白(P=0.003)和血沉水平(P=0.005)有正相关性。MMP-8基因表达与患者的性别、职业、吸烟习惯、疼痛强度、患病的脊柱节段、症状持续时间等无相关性(P＞0.05)。剧烈疼痛患者（VAS8-10）的MMP-8表达水平比轻度疼痛患者（VAS0-4）显著增大(P<0.05)。高CRP患者（>30mg/L）的MMP-8表达水平比低CRP患者（<10mg/L）显著增大(P<0.05)。高ESR患者（>40mm/h）的MMP-8表达水平比低ESR患者（<20mm/h）显著增大(P<0.05)。脊柱结核组：MMP-9基因表达与疼痛强度(P=0.026)、症状持续时间(P=0.021)、C-反应蛋白(P=0.006)和血沉水平(P=0.013)有正相关性。MMP-9基因表达与患者的年龄、性别、职业、患病的脊柱节段等无相关性(P＞0.05)。剧烈疼痛患者（VAS8-10）的MMP-9表达水平比轻度疼痛患者（VAS0-4）显著增大(P<0.05)。3–12months症状持续时间患者的MMP-9表达水平比<3months症状持续时间患者显著增大(P<0.05)。高CRP患者（>30mg/L）的MMP-9表达水平比低CRP患者（<10mg/L）显著增大(P<0.05)。脊柱结核组：MMP-13基因表达与吸烟习惯(P=0.019)、疼痛强度(P=0.016)、症状持续时间(P=0.012)、C-反应蛋白(P=0.002)和血沉水平(P=0.009)有正相关性。MMP-9基因表达与患者的年龄、性别、职业、患病的脊柱节段等均无相关性(P＞0.05)。剧烈疼痛患者（VAS8-10）的MMP-13表达水平比轻度疼痛患者（VAS0-4）显著增大(P<0.05)。3–12months症状持续时间患者的MMP-13表达水平比<3months症状持续时间患者显著增大(P<0.05)。高ESR患者（>40mm/h）的MMP-13表达水平比低ESR患者（<20mm/h）显著增大(P<0.05)。脊柱结核组和椎间盘突出组：MMP-14基因表达与患者的年龄、吸烟习惯、性别、职业、疼痛强度、患病的脊柱节段、症状持续时间、C-反应蛋白和血沉水平均无相关性(P＞0.05)。4结论4.1本研究证实椎间盘组织中ADAMTS-4的表达情况与椎间盘结核性破坏有关，推测ADAMTS-4在脊柱结核椎间盘破坏的发病机制中发挥了重要的作用。研究证实退变性腰椎间盘组织的ADAMTS-4表达显著增高，ADAMTS-4在椎间盘突出症的发病机制中发挥了重要的作用。4.2本研究证实椎间盘组织中MMP-3，-8,-9,-13,-14的表达情况与椎间盘结核性破坏有关，推测MMP-3，-8,-9,-13,-14在脊柱结核椎间盘破坏的发病机制中发挥了重要的作用。研究证实退变性腰椎间盘组织的MMP-3，-13,-14表达显著增高，MMP-3，-13,-14在椎间盘突出症的发病机制中发挥了重要的作用。4.3本次研究证实MMP-8，-9，-13在椎间盘结核性破坏的过程中发挥了协同作用。研究证实MMP-3，-8，-9，-14表达水平与椎间盘结核性破坏的严重程度具有相关性。4.4本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-3，-13的表达情况与吸烟习惯有正相关性，推测吸烟是影响脊柱结核预后的不利因素。本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-8,-9，-13的表达情况与疼痛强度有正相关性，推测疼痛可能通过增加炎性反应的途径，加重脊柱结核病的病情。本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-9，-13的表达情况与症状持续时间有相关性，推测症状持续时间长短是影响脊柱结核预后的相关因素。本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-8,-9，-13的表达情况与CRP有正相关性，推测高水平的CRP是影响脊柱结核预后的不利因素。本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-8,-9，-13的表达情况与ESR有正相关性，推测高水平的ESR是影响脊柱结核预后的不利因素。
【作者】熊春翔；
【导师】詹新立；
【作者基本信息】广西医科大学，脊柱骨病外科，2014，博士
【关键词】脊柱结核；MMPs；ADAMTS-4；椎间盘；基因；

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