胃肠间质瘤多基因全序列联合检测及预后因素研究

【摘要】目的研究分析胃肠间质瘤相关基因KIT、PDGFRA和DOG1突变的情况，探讨其在胃肠间质瘤发病机制中的意义。探讨性研究临床特点、病理特征和基因突变等因素对胃肠间质瘤患者预后的影响。方法1.病例资料：收集100例来源于广西医科大学第一附属医院2002年5月至2013年5月收治的胃肠间质瘤病例的临床病理资料。2.标本采集：采集100例胃肠间质瘤患者肿瘤的石蜡包埋组织标本和新鲜标本。3.DNA提取：提取以上石蜡包埋组织标本和新鲜肿瘤标本的DNA。4.通过GenBank检索出KIT，PDGFRA，DOG1三个基因的全部序列以及外显子。5.针对KIT，PDGFRA，DOG1三个基因的全部外显子片段进行引物设计,其中KIT21个外显子，PDGFRA22个外显子，DOG126个外显子。6.聚合酶链式反应扩增出KIT，PDGFRA，DOG1三个基因的全部外显子片段。7.对扩增出的KIT，PDGFRA，DOG1基因全部外显子片段进行直接测序。8.测序结果与NCBI基因库中KIT、PDGFRA和DOG1基因序列进行比对找出突变的位点及突变类型。9.随访GIST患者的生存资料并分析其临床表现及病理特征。10.统计学分析：全部资料使用SPSS17.0软件进行统计分析。生存率统计采用Kaplan-Meier法，生存率比较用log-rank检验，单因素分析采用Kaplan-Meier法以及多因素分析采用Cox回归分析，P<0.05差异有统计学意义。结果测序结果与GenBank上的序列进行比较后显示：100例GIST中KIT基因突变75例，突变率为75.0%。其中突变发生在第11外显子59例（占全部GIST病例的59.0%)，发生在第9外显子11例(11.0%)，发生在第13外显子3例(3.0%)，发生在第17外显子突变2例(2.0%)。其中杂合突变65例(占KIT基因突变的86.7%），纯合突变10例（13.3%）。突变的形式包括缺失突变51例（占KIT基因突变的68.0%），点突变18例（24.0%），插入突变7例（9.3%）,其中有一例缺失性突变与插入性突变共存。第11外显子突变的位点集中在密码子550～570位的44例占全部第11外显子突变的74.6%，此区间被称为“热点区域”。在第11外显子突变中，缺失性突变（51例）是最常见的突变形式，其次是点突变（8例），插入突变（1例）与缺失性突变共同存在。在第9外显子突变中最常见的就是密码子502和503位6个核苷酸GCCTAT重复插入突变（6例）；余下5例均为点突变。外显子13突变3例和外显子17突变2例都是点突变。本组100例胃肠间质瘤中检测出PDGFRA基因突变16例（16.0%），其中第18号外显子突变8例（占全部GIST病例的8.0%）；第12号外显子突变5例（5.0%）；第14号外显子突变1例（1.0%）；第11号外显子突变1例（1.0%）；第8号外显子突变1例（1.0%）。PDGFRA基因最常见的突变位点发生在第18外显子的842密码子为5例，其中D842V有4例。在第18外显子突变中，包括5例点突变，2例缺失性突变和1例插入性突变。在第12外显子突变中，包括4例点突变和1例插入性突变。第8外显子突变的位点在密码子392位，导致由原来的酪氨酸变成丝氨酸。第11外显子突变的位点在密码子521位，导致由原来的亮氨酸变成脯氨酸。第14外显子突变的位点在密码子632位，导致由原来的苏氨酸变成赖氨酸。本组100例胃肠间质瘤中，检测出DOG1蛋白阳性94例，没有检测出DOG1基因突变。本组100例胃肠间质瘤中，91例检测到KIT或PDGFRA基因有一种基因突变，其中有9例（9.0%）没有检测到发生KIT或PDGFRA基因突变，属于野生型。本组100例胃肠间质瘤患者5年生存率为58.8%。单因素分析发现，原发部位、大小、有无转移、有无根治性切除、细胞学类型、有无侵犯周围组织、有无平滑肌受侵犯、核分裂象数目、有无KIT基因11外显子缺失性突变和有无接受靶向治疗（甲磺酸伊马替尼）等因素对患者的生存率的影响有统计学意义。进一步通过Cox回归分析对上述因素进行多因素分析。结果提示肿瘤大小、有无转移、有无根治性切除、有无侵犯周围组织、核分裂象数目、有无KIT基因11外显子缺失性突变和有无接受靶向治疗（甲磺酸伊马替尼）是影响患者预后的独立因素。结论1.KIT和PDGFRA基因突变在胃肠间质瘤的发生发展中可能起重要作用。2.KIT的突变和PDGFRA的突变不会相互重叠。它们通过不同的作用位点，激活相同细胞信号途径导致GIST的发生。3.本文首次报道了KIT，PDGFRA，DOG1三个基因全序列检测结果，KIT基因突变只在第11、9、13、17外显子上被观察到，其他外显子未见突变；首次发现PDGFRA基因突变可以发生在第8和11外显子上。4.DOG1蛋白高表达于胃肠间质瘤的机制与DOG1基因突变无关。DOG1蛋白只是GIST的一种偶然标志物，与酪氨酸激酶和信号传导系统无关,其产生机制有待进一步研究。5.GIST的肿瘤大小、有无转移、有无根治性切除、有无侵犯周围组织、核分裂象数目、有无KIT基因11外显子缺失性突变和有无接受靶向治疗（甲磺酸伊马替尼）影响预后的独立因素。6.早期诊断和以手术为主、辅以甲磺酸伊马替尼靶向治疗的综合治疗能够提高GIST患者的生存率。
【作者】李杰华；
【导师】陆云飞；
【作者基本信息】广西医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】胃肠间质瘤；KIT；PDGFRA；DOG1；突变；预后；

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