腺淋巴瘤内磷脂酰胆碱的分布与其代谢及病理机制的研究

【摘要】腺淋巴瘤（WarthinTumor）也被称为乳头状淋巴性囊腺瘤或单形性腺瘤，是第二常见的唾液腺良性肿瘤。其结构主要包括两个部分：肿瘤上皮组织及淋巴间质。淋巴腺瘤组要影响60至70岁人群，吸烟被认为于该疾病密切相关。虽然以往的研究对于腺淋巴瘤的起病及进程进行了很多探讨，也设立了很多假说，但其病理机制至今仍不明确。大多数学者对腺淋巴瘤的研究多着重于基因组学及蛋白组学。而对于脂质组学这一门新兴学科，其在腺淋巴瘤中的研究甚少。尤其是对于脂质在腺淋巴瘤中的分布及组成，尚未发现任何报道。脂质是人体细胞中不可或缺的重要组成部分，其包括脂肪、水溶性维生素、甘油脂类、磷脂类等一系列生物活性物质。其不但参与生物膜构建，细胞增值、分化、代谢调节及免疫，而且涉及到储存能量、传递信号等生物活动。磷脂酰胆碱，又称为卵磷脂，为磷脂类的一种，其为细胞膜磷脂双分子层的主要成分，并且更多的存在于双分子层的外侧。磷脂酰胆碱成分在细胞及细胞膜内的改变被认为与细胞内生物信号的传送及各类细胞的新陈代谢有关。其对肿瘤的形成、增长及转归起到重要的作用。磷脂酰胆碱的特性是由其绑定的脂肪酸种类决定，因此，比较正常和病理组织中不同脂质的分布，尤其是不同脂肪酸的分布，能够获得代谢调控中关键的脂质标志物,最终揭示脂质在肿瘤活动中的作用机制。质谱成像（ImagingMassSpetrometry,IMS）是一种最新的原位分析技术。其利用质谱直接扫描生物样品，分析分子在细胞或组织中的“结构、空间与时间分布”信息。此技术以质谱为基础，不局限分析特异的一种或者几种生物分子。质谱成像不但能够在短时间内一次性检测多种生物分子的空间分布，而且不需要烦杂的样本准备过程，更不需要任何免疫技术进行检测前的标记。作为唯一能够使绑定在脂质上的脂肪酸可视化的技术，质谱成像能够将绑定有不同脂肪酸种类的磷脂酰胆碱定位，以直观的方式观察各种磷脂酰胆碱在生物样本上的分布情况。为了更全面更深入地了解腺淋巴瘤的病理特征，为探究此疾病的发生发展及病理机制提供更多的理论依据。本实验利用人类腺淋巴瘤病理样本作为研究对象，采用质谱成像技术比较样本的肿瘤及非肿瘤ROI内磷脂酰胆碱的分布情况，并获得腺淋巴瘤特异性信号分子。进一步采用串联质谱法识别这些特异性分子，从而获得腺淋巴瘤内磷脂酰胆碱的组成情况并讨论其意义。方法：将术后获得的8个病理样本采用冰冻切片机进行组织样本的连续切片，样本厚度为10μm。将所获得的连续切片分别放置于ITO包埋及MAS包埋的载玻片上，用于IMS检测及HE染色。通过HE染色来确认腺淋巴瘤及非瘤组织的ROIs。通过对质谱成像仪参数的设定，将质荷比调整至m/z460-m/z1000范围用于脂质，特别是磷脂的检测。获得IMS检测数据后，通过flexImaging软件比较肿瘤及非肿瘤ROIs的质谱，质谱中每个信号峰即代表一种生物分子。通过SIMtools软件对获得的质谱进行信号峰进行挑选，同时观察相应信号峰对应的生物分子的离子成像图，判断各个生物分子的大概分布趋势。随后通过统计学分析比较各个信号峰在肿瘤及非肿瘤ROI的信号强度，以p<0.01为标准，获得相应区域的特异性信号即生物分子。最后，运用串联质谱法，通过观察离子碎片质谱以及各个离子碎片信号峰之间的质量差，即中性丢失，并根据此离子碎片质谱检索“人类代谢组数据库”(http://www.hmdb.ca/spectra/ms/search)，获得候选生物分子，从而识别上述步骤中获得的特异性生物分子。实验结果:(1)HE染色显示腺淋巴瘤的典型结构，包括肿瘤上皮及淋巴间质。(2)比较肿瘤及非肿瘤ROI的质谱，m/z740-m/z940区域内的信号峰有较大区别，此区域大部分信号峰在肿瘤ROI有较高强度。经过挑选后，此区域的15个信号峰被纳入随后的分析。(3)离子成像图显示的结果与质谱基本一致，15个信号中大部分在肿瘤ROI有较高的信号强度。其中m/z796.5,m/z895.5,m/z897.5andm/z923.5主要分布在非肿瘤ROI，m/z782.5andm/z798.5在肿瘤与非肿瘤ROI的分布未见明显区别。而剩下的九个信号则在肿瘤ROI有较高的信号强度。(4)统计学分析比较肿瘤及非肿瘤ROI中15个信号的强度，发现其中10个信号峰的信号强度在肿瘤及非肿瘤ROI有明显的差异，其差别具有统计学意义。其中，m/z796.5的信号强度在非肿瘤ROI中较高；其余九个信号:m/z741.5,m/z772.5,m/z820.5,m/z822.5,m/z824.5,m/z826.5,m/z844.5,m/z846.5andm/z848.5，在肿瘤ROI有较高信号强度。(5)在所有组织样本中按上述方法检测获得的九个信号的强弱，并确认各个信号在肿瘤ROI的部位。离子成像图结果显示，m/z741.5及m/z772.5重要分布于腺淋巴瘤的淋巴间质区域，m/z822.5,m/z824.5及m/z826.5则分布在肿瘤上皮和淋巴间质中，m/z820.5,m/z844.5,m/z846.5及m/z848.5则主要位于肿瘤上皮区域。最终，五个信号，即m/z772.5，m/z820.5，m/z822.5，m/z844.5及m/z846.5被发现始终于肿瘤ROI保持高强度，因此被确定为腺淋巴瘤特异性信号。(6)通过MS/MS识别这个五个腺淋巴瘤的特异性信号所代表的生物分子。m/z772.5为PC(diacyl-16:0/16:0)，m/z820.5为PC(diacyl-16:0/20:4)，m/z822.5为PC(diacyl-16:0/20:3)，m/z844.5为PC(diacyl-18:2/20:4)，andm/z846.5为PC(diacyl-18:0/20:5)。(7)对照HE染色以及m/z772.5即PC(diacyl-16:0/16:0)的离子成像图发现，此磷脂酰胆碱主要分布在腺淋巴瘤的淋巴基质区域，特别集中在淋巴滤泡的部位。结论：IMS技术能成功的检测磷脂酰胆碱在腺淋巴瘤的肿瘤及非肿瘤ROI的空间分布及信号强度。通过此技术，五种磷脂酰胆碱被发现在腺淋巴瘤内特异性的增高，即m/z772.5为PC(diacyl-16:0/16:0)，m/z820.5为PC(diacyl-16:0/20:4)，m/z822.5为PC(diacyl-16:0/20:3)，m/z844.5为PC(diacyl-18:2/20:4)，andm/z846.5为PC(diacyl-18:0/20:5)。其中PC(diacyl-16:0/20:3)主要位于肿瘤上皮区域，PC(diacyl-16:0/20:4)，PC(diacyl-18:2/20:4)及(diacyl-18:0/20:5)则位于肿瘤和淋巴间质区域，而PC(diacyl-16:0/16:0)则特异性在腺淋巴瘤淋巴间质，特别是淋巴滤泡内增加。
【作者】何倩；
【导师】苏纪平；
【作者基本信息】广西医科大学，耳鼻咽喉头颈外科，2014，博士
【关键词】腺淋巴瘤；质谱成像技术；磷脂酰胆碱；多不饱和脂肪酸；十六烷酸；

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