牛乳中α-酪蛋白三种ELISA检测方法的研究

【摘要】α-酪蛋白是牛乳蛋白中含量最高的蛋白，约占牛乳蛋白总量的40%左右，并且，其在牛乳中的含量相对稳定，因此，可以将其含量作为检测牛乳中是否掺入其他蛋白质的检测指标。本研究以两α-酪蛋白标准品：大分子（C-6780）和含有六个氨基酸的寡肽（C-1658）作为研究对象。以大分子作为免疫原，通过对BALB/C小鼠进行腹腔免疫注射，三免后检测小鼠阳性血清效价，达到细胞融合的要求之后，取出其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合。阳性杂交瘤细胞株的筛选是使用ELISA方法进行检测融合后的细胞的培养基上清液的情况进行的，由此筛选出阳性株，进而通过有限稀释法对其亚克隆，获得一株单克隆抗体细胞株4H3，其能够稳定地分泌抗α-酪蛋白的抗体，并且，经鉴定其抗体亚类为IgG1。通过对小鼠进行体内诱生法获得腹水，使用亲和层析法对其进行纯化。同样以大分子作为免疫原，对新西兰大白兔进行颈背部散点注射和大腿内侧肌肉注射的方法进行免疫，对其进行心脏采血，对全血进行处理后得到抗大分子的多克隆抗体。并鉴定了所获得的单抗和多抗的性质，奠定了建立免疫学检测方法的基础。由于寡肽属于小分子物质，不能刺激机体产生抗体，因此，通过戊二醛法制备完全抗原：免疫原寡肽-BSA和检测原寡肽-OVA。以寡肽-BSA作为免疫原，对新西兰大白兔进行颈背部散点注射和大腿内侧肌肉注射的方法进行免疫，对其进行心脏采血，对全血进行处理后得到抗寡肽-BSA的多克隆抗体。初步鉴定了多抗的性质，奠定了建立免疫学检测方法的基础。选取柠檬酸三钠还原法制备了20nm的胶体金溶液，使用透射电镜对其进行鉴定。将酶标二抗标准品与胶体金进行偶联，并通过透射电镜进行结果鉴定。本研究建立了三种ELISA检测方法：第一种是夹心ELISA方法。此方法使用纯化后的抗大分子的单抗和多抗，建立了单抗-抗原-酶标多抗的标准曲线，标准品浓度在0.25-16μg/mL范围内呈现出较好的线性关系，曲线方程为y=1.3260x+6.1163，相关系数R2=0.9934。最低检测限为15ng/mL。第二种是胶体金-ELISA方法，此方法使用纯化后的抗大分子的单抗，建立了单抗-抗原-金标酶标二抗的标准曲线，其线性回归方程为y=0.3012x+2.3311，相关系数R2=0.9800。线性检测范围为0.1-4μg/mL，最低检测限为0.1μg/mL。第三种是竞争ELISA方法，以抗寡肽-BSA的多抗建立了竞争ELISA方法的标准曲线，标准品浓度在1-2×106ng/mL范围内呈现出较好的线性关系，曲线方程为y=13.301x+91.457，相关系数R2=0.9930。最低检测限为1ng/mL。通过对上述三种方法的对比，间接竞争ELISA方法的线性检测范围更广，检测限更低，耗费的牛奶样品的含量也较少，但是检测耗费的时间比其他两种方法更长。
【作者】褚晓红；
【导师】周玉；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】α-酪蛋白；ELISA；胶体金；单克隆抗体；多克隆抗体；

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