兔脂肪干细胞与软骨细胞微球间接共培养最适诱导比例的实验研究

【摘要】软骨一旦损伤便无法自行修复，组织工程的兴起为解决这一难题提供了新的方法。脂肪干细胞（Adipose-derivedstemcells，ADSCs）因来源丰富，取材方便且创伤小等优点而成为软骨组织工程理想的种子细胞，然而目前并没有一种公认高效的诱导方法。传统的诱导方法用到大量的生长因子如TGF-βs、BMPs等,费用高半衰期短，而且避免不了在ADSCs发生稳定软骨向分化的同时发生早期肥大。已知正常关节软骨微环境可以诱导ADSCs向软骨细胞分化，因此近年来利用ADSCs和软骨细胞共培养的方法诱导ADSCs向软骨分化的研究越来越多，但共培养的机制及两种细胞的最佳比例有待进一步探讨。研究目的：本研究的目的有两个：（1）通过Transwell间接共培养ADSCs与软骨细胞，得出能够使被诱导的ADSCs最大程度的表达软骨特异性细胞外基质，同时使Col-Ⅹ等软骨肥大化标志无明显上调时ADSC与软骨细胞的比例；（2）比较生长因子诱导与共培养诱导对ADSCs发生软骨向分化的差别。研究方法:1、ADSCs和软骨细胞的分离培养及鉴定：无菌取2-4周龄新西兰白兔肾周脂肪，Ⅰ型胶原酶消化后，结合差速贴壁法分离提纯干细胞(ADSCs)，传至第3代，分别进行成骨、成脂诱导并通过茜素红，油红O染色鉴定诱导结果。取膝关节软骨，经Ⅱ型胶原酶过夜消化，离心收集体外扩增，阿利新兰染色鉴定结果。2、ADSCs和软骨细胞微球的制备：分别以5xl05个细胞制备微球，在常规培养液中培养2-3天后共培养。3、ADSCs和软骨细胞的共培养及分组：将ADSCs和软骨细胞微球分置于孔径为0.4μm的Tranwell的上下层，建立共培养体系，实验共分为9组：组1为单纯下层的软骨细胞球，作为阳性对照组1，用普通培养基（H-DMEM，1％ITS，40μg/ml的L-脯氨酸，50μg/ml抗坏血酸，1％青/链霉素，2.5μg/ml两性霉素B）培养；组2为单纯上层的ADSCs球，培养方式同组1，为阴性对照组；组3为单纯上层的ADSCs球，用诱导培养基（比普通培养基多加了10ng/mlTGF-β3+10ng/mlBMP-6+0.1mM地塞米松）培养，为阳性对照组2。组4到组9为实验组，为将ADSCs球和软骨细胞球以不同比例（0.5:1;1:1;1:2;1:3;1:5;1:7）共培养，培养方式为同组1和组2。共培养28天后分别行组织形态学观察，COL-Ⅱ、COL-Ⅹ和GAG蛋白水平的定性定量检测。研究结果：1、提取的ADSCs增殖迅速，原代呈集落样生长,传代后多为长梭形，排列规则，呈漩涡状。多向分化诱导后油红O染色脂滴呈红色、茜素红染色钙结节呈深粉红色；培养的透明软骨贴壁迅速，生长良好，轮廓清楚，阿利新蓝染色呈典型的软骨细胞形态，胞浆呈蓝色。2、Transwell微球共培养28天后，阿利新蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色显示除了阴性对照组外，各组结果均为阳性，然而相比于阳性对照组1的强阳性表现，比例为0.5:1和1:1的两组阳性较弱。Ⅹ型胶原在各组均表现为阳性，但在生长因子对照组的阳性表达最为强烈，超过了任何一个共培养组。通过二甲基亚甲蓝分光光度法(DMMB法)检测诱导后的ADSCs的总GAG含量结果显示，与阴性对照组相比，总GAG含量在共培养组均有所增加，两者相比差异有统计学意义（P<0.05），且增加量与软骨细胞的比例呈正相关，但是在ADSC：AC比例达到1:5之后反而有所下降。通过羟（基）脯氨酸检测（Hydroxyprogesterone，OHP）到的总胶原蛋白的变化类似于GAG的变化。组8（ADSC：AC为1:5）的总胶原量较其他共培养组均较高，甚至达到了阴性对照组的7.3倍。研究结论：1、分离的ADSCs具有成脂（油红O染色阳性）、成骨（茜素红染色阳性）和成软骨（甲苯胺蓝染色阳性）的能力；2、ADSCs与软骨细胞通过Transwell间接共培养可以使ADSCs发生软骨向分化，两种细胞不同比例对ADSCs分化成软骨细胞的能力及新生软骨的性状影响较大，能够使被诱导的ADSCs最大程度的表达软骨特异性细胞外基质的最佳比例为1:5；3、共培养诱导较生长因子诱导能够抑制ADSCs软骨向分化后的肥大问题（COL-Ⅹ表达减少）。
【作者】赵明璨；
【导师】刘畅；
【作者基本信息】吉林大学，口腔医学，2014，硕士
【关键词】软骨细胞；脂肪干细胞；微球；共培养；Transwell；

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