CD4+IL9+T细胞在结直肠癌免疫微环境中分布、表型、分化与募集的实验研究

【摘要】第一部分CD4+IL-9+T细胞在结直肠肿瘤微环境及外周血的分布及临床意义目的检测CD4+IL-9+(Th9）T细胞在结直肠癌免疫微环境中、癌旁及外周血中分布比例，分析其与临床病理的相关性及其与其他CD4+T亚型分布的相关性。方法首先，选取5例结直肠癌患者对其肿瘤和癌旁正常组织中CD4和IL-9的蛋白表达进行免疫荧光鉴定。另选取2013年6月5号至12月10号在广西医科大学第一附属医院结直肠外科初次行手术治疗的45例结直肠癌患者的肿瘤组织、相对应癌旁正常组织和外周血（术前、术后），同时抽取15例健康志愿者外周血，用流式细胞仪检测各标本中CD4+IL-9+T细胞在CD4+T细胞中所占的比例，同时检测这45例患者肿瘤组织Th1、Th2以及Th17细胞的分布比例；记录患者的临床病理资料（性别、年龄、民族、Duke’s分期、肿瘤大小、肿瘤位置、淋巴结转移情况、CEA和AFP水平）。比较CD4+IL-9+T细胞在肿瘤组织、相对应癌旁正常组织以及外周血（术前、术后）、健康人外周血中的分布差异；分析肿瘤组织中CD4+IL-9+T的分布与患者临床病理的相关性；比较肿瘤组织中CD4+IL-9+T的分布与Th1、Th2以及Th17细胞比例的相关性。结果免疫双染色法显示，CD4+IL-9+T细胞表达于结直肠癌肿瘤和癌旁正常组织中；肠癌组织中的CD4+IL-9+T细胞比例（1.12±0.33%）明显高于癌旁正常组织（0.85±0.29%）和术前（0.65±0.27%）、术后（0.47±0.24%）以及健康人外周血（0.43±0.25%），P<0.05；术前外周血CD4+IL-9+T细胞比例明显高于术后外周血和健康人外周血，P<0.05；CD4+IL-9+T细胞与肠癌临床病理相关性分析表明，其与Duke’s分期有关，P<0.05，与患者性别、年龄、民族、肿瘤大小、肿瘤位置、淋巴结是否转移没有明显相关性，P>0.05；Pearson相关性分析显示CD4+IL-9+T细胞的分布特征与CEA不相关（r=-0.46，P=0.810），与患者AFP水平亦不相关（r=0.281，P=0.133）；肠癌组织中CD4+IL-9+T细胞比例与Th1细胞无明显相关（r=0.140，P=0.360），与Th2细胞比例成负相关性（r=-0.65，P<0.001），CD4+IL-9+T细胞与Th17细胞比例成正相关性，r=0.367，P=0.013。结论CD4+IL-9+T细胞表达于结直肠癌肿瘤免疫微环境中，且其分布比例高于癌旁和外周血，呈现聚集效应；CD4+IL-9+T细胞的分布比例与结直肠癌Duke’s分期相关，其可能参与了结直肠癌的发生发展。第二部分结直肠癌免疫微环境CD4+IL-9+T细胞表型、相关细胞因子表达及临床意义目的研究结直肠癌肿瘤免疫微环境中CD4+IL-9+T细胞的表型特征，相关细胞因子、转录因子以及趋化因子的表达水平，探讨其与临床病理的相关性。方法采集上述45例经病理确诊的结直肠癌患者肿瘤组织和相应癌旁正常组织，以及外周血（术前及术后），同时抽取同期临床特征相似的15例健康志愿者外周血。运用实时荧光定量PCR技术检测上述组织和外周血中CD4+IL-9+T细胞主要细胞因子IL-9、IL-10和转录因子PU.1、IRF4以及趋化因子CCL2、CCL5、CCL20、CCL22和CCL27的表达；运用液相蛋白芯片技术测定细胞因子IL-9、IL-10在上述组织和外周血中的浓度。另选取10例同期病理证实的结直肠癌患者肿瘤组织标本，运用流式细胞技术对位于肿瘤微环境中CD4+IL-9+T细胞表面的T细胞功能标记（HLA-DR、CD25、PD-1、Foxp3、CD45RO和CD45RA）以及趋化因子受体（CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5和CCR6）表达测定。结果结直肠癌肿瘤微环境中的CD4+IL-9+T细胞表面低表达HLA-DR（5.4±2.9%）、CD25（1.7±1.3%），PD-1（4.9±3.2%）,Foxp3（2.5±1.6%）和CD45RA分子（2.3±1.8%），而高表达CD45RO分子（83.2±31.5%）；CD4+IL-9+T细胞表面低表达CCR1（7.89±3.42%）、CCR3（3.15±1.56%）、CCR4（8.69±4.25%），CCR6（2.56±1.34%）受体，而高表达CCR2（79.53±24.12%）,CCR5（72.34±21.69%）受体。RT-PCR检测结果表明，IL-9的基因相对表达量（2.21±1.634）高于相对应的癌旁正常组织（1.38±1.68）,亦高于术前、术后外周血及健康人外周血，P<0.05；术前外周血IL-9基因相对表达量高于术后外周血，也高于健康人外周血，P<0.05；细胞因子IL-10在结直肠癌肿瘤微环境中的相对表达量为1.78±0.95，高于相应的癌旁正常组织表达量1.28±0.59，P=0.075，也高于其在患者术前、术后外周血以及健康人外周血中的表达，P<0.05；细胞因子IL-10在患者术前外周血中的相对表达量高于术后和健康人外周血，P<0.05。液相蛋白芯片检测结果显示，细胞因子IL-9在结直肠癌患者微环境中的浓度为0.82±0.65pg/ml，高于癌旁0.59±0.53pg/ml,P=0.0308；同时，它也高于术前、术后及健康人外周血中IL-9的浓度，P<0.05；细胞因子IL-10在结直肠癌患者微环境中的浓度高于癌旁，分别为0.75±0.53和0.56±0.51pg/ml，P<0.05，它也高于术前、术后及健康人外周血中IL-10的浓度，P<0.05。相关性分析显示，结直肠癌患者肿瘤微环境中的细胞因子IL-9的蛋白水平与患者的年龄、性别、民族、淋巴结是否转移、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度没有明显相关性，P>0.05；与肿瘤Duke’s分期存在相关性，P<0.05，分期越高IL-9的蛋白水平越高。细胞因子IL-10与上述临床病理因素无明显病理相关性。RT-PCR结果显示趋化因子CCL5在肿瘤微环境中的表达高于癌旁正常组织，P<0.05，也高于术前、术后外周血及健康人外周血中的表达，P<0.05；CCL2在肿瘤微环境中的表达量比癌旁正常组织低，P<0.05，但与术前、术后外周血及健康人外周血中的表达无明显差异，P>0.05；趋化因子CCL22在在肿瘤微环境的表达高于癌旁、术前与术后外周血、健康外周血中的表达，P<0.05，趋化因子CCL20、CCL-27的表达也具有相似的结论。RT-PCR检测结果显示，PU.1基因在肿瘤组织中表达量（1.12±0.30）高于癌旁正常组织中相对表达量（0.86±0.42）,P=0.005；IRF4在肿瘤和癌旁正常组织中的表达量各为0.45±0.11和0.43±0.10,P=0.392，无明显差异。Pearson相关性分析显示PU.1基因表达量与CD4+IL-9+T分布呈现正相关性（r=0.346,P=0.020）；Pearson相关性分析显示IRF4基因表达量与CD4+IL-9+T没有明显相关性(r=0.055，P=0.721)。结论结直肠癌肿瘤微环境中的CD4+IL-9+T细胞拥有独特的T细胞功能标记和趋化因子受体表达谱。结直肠癌肿瘤微环境中高表达CD4+IL-9+T细胞主要细胞因子IL-9和IL-10、趋化因子CCL5以及特异性转录因子PU.1。结直肠肿瘤微环境中的CD4+IL-9+T细胞高表达CCR2与CCR5趋化因子受体，高表达的的趋化因子CCL5和受体CCR5相互作用可能是CD4+IL-9+T细胞在结直肠癌免疫微环境中募集的机制之一。第三部分结直肠癌免疫微环境CD4+IL9+T细胞分化、募集机制及IL-9、IL-10对结直肠癌细胞株生长、凋亡与迁移的影响目的探讨结直肠癌免疫微环境中CD4+IL9+T细胞分化、募集机制及细胞因子IL-9、IL-10对肠癌细胞株SW480生长、凋亡、迁移和侵袭的影响方法采用免疫磁珠分选法从结直肠癌肿瘤微环境中阳性分选初始CD4+T细胞，然后单独或联合添加细胞因子IL-4和TGF-β刺激培养，运用流式细胞技术和RT-PCR技术分别检测不同因子刺激后CD4+IL-9+T细胞的比例以及相关细胞因子IL-9、IL-10和转录因子PU.1，IRF4的表达量，比较各细胞因子干预组之间的差异；选取趋化因子CCL2、CCL5、CCL20、CCL22进行趋化试验，观察其对来自结直肠癌免疫微环境中CD4+IL-9+T细胞的招募能力；将细胞因子IL-9和IL-10分别添加至SW480人大肠癌细胞系中培养，通过迁移实验和侵袭实验以及增殖和凋亡实验分析IL-9和IL-10对SW480细胞迁移和侵袭能力以及增殖和凋亡的影响。结果我们采用免疫磁珠阳性分选的方法从结直肠癌癌组织中分选出高纯度的初始CD4+细胞，经流式细胞技术检测阳性率达97.7%；流式细胞技术结果显示，细胞因子IL-9、IL-10联合刺激组对CD4+IL-9细胞的诱导分化能力最强，明显优于空白组、IL-4组，TGF-β组，其诱导刺激后CD4+IL-9+T的比例分别为1.35±0.45%、1.72±0.77%、3.47±1.75%、10.7±2.94%。IL-4组与空白组中CD4+IL-9细胞比例差别无统计学意义，P>0.05，TGF-β组高于IL-4组和空白组，P<0.05。RT-PCR检测结果显示，IL-4和TGF-β联合组诱导下CD4+IL-9+T相关细胞因子IL-9，IL-10和转录因子PU.1、IRF4的表达量较之空白组、IL-4组和TGF-β组均显增高，P<0.05，差异具有统计学意义；TGF-β组诱导下细胞因子IL-9表达高于空白组，P<0.05，其余各组间比较差异无统计学意义。趋化试验结果显示，趋化因子CCL5、CCL22对CD4+IL-9+T细胞具有较强的趋化作用，优于空白组和趋化因子CCL2、CCL20，差异存在统计学意义（P<0.05）。趋化因子CCL2、CCL20对CD4+IL-9+T细胞作用不明显，与空白组相比差异无统计学意义。Transwell迁移和侵袭实验结果显示，细胞因子IL-9干预后能明显增强SW480细胞的侵袭和迁移能力，其作用效果优于IL-10组和空白组；细胞因子IL-10对SW480细胞株的侵袭与迁移作用不明显，与对照组效果相当。流式细胞技术分析结果显示，细胞因子IL-10和IL-9干预均能促进SW480细胞的增殖，增殖率（S/G2期）均比空白对照组显著增高，p<0.05，差异具有统计学意义；IL-9干预组SW480细胞凋亡率明显低于IL-10干预组和空白对照组，P<0.05,差异具有统计学意义；而细胞因子IL-10对SW480细胞凋亡的抑制作用不明显，与对照组凋亡率相当，差异无统计学意义，P>0.05。结论我们的研究进一步证实TGF-β和IL-4可有效促进初始CD4+T细胞向CD4+IL-9+T细胞分化，其诱导分化能力优与单独使用；IL-9可有效的促进SW480细胞迁移和侵袭，并能够促进它的增值且抑制它的凋亡，干预IL-9的信号通路或者降低IL-9的活性或许能够成为治疗结直肠肿瘤的新靶点.
【作者】张磊昌；
【导师】陈利生；
【作者基本信息】广西医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】结直肠癌；CD4+IL-9+T细胞；免疫微环境；

【参考文献】
[1]刘畅.国内商业银行汽车行业供应链金融服务研究[D].北京交通大学,2013.
[2]姜伟.螺旋槽管材滚压成型的数值模拟及实验研究[D].燕山大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[3]秦春燕.长江三角洲淡水底栖动物耐污值修订和BI指数水质评价分级研究[D].南京农业大学,农业昆虫与害虫防治,2013,硕士.
[4]缪天琳.小花琉璃草多糖提取工艺优化及生物活性研究[D].佳木斯大学,生药学,2014,硕士.
[5]李磊.《红楼梦》中称谓词的翻译研究[D].河北师范大学,语言学,2013,硕士.
[6]胡媛.老庄道家思想及其对大学生人格教育的启示[D].浙江工业大学,2013.
[7]祝景愉.论清代自首制度及其在司法实践中的运用[D].吉林大学,法律史,2013,硕士.
[8]张学萌.中国海运服务贸易与货物贸易的相关性研究[D].大连海事大学,国际贸易学,2013,硕士.
[9]王敏.高校维吾尔语专业学习者翻译式偏误分析[D].新疆师范大学,中国少数民族语言文学,2013,硕士.
[10]辛蕾.“项目与迁移”模式在高职旅游类专业教学中的应用研究[D].广西师范大学,课程与教学论（专业学位）,2013,硕士.
[11]尹爱宁.试论建立中医药数据仓库[A].中国中医药信息研究会.中国中医药信息研究会第二届理事大会暨学术交流会议论文汇编[C].中国中医药信息研究会:,2003:7.
[12]严又生,宜明理,魏新,万文曼,常连吉.JL油田井间地震测量及纵、横波速度层析成像[J].石油地球物理勘探,1998,06:749-757+824.
[13]金凤凤.基于摄像头图像的汉信码识别系统及相关加密算法[D].吉林大学,计算数学,2014,硕士.
[14]罗倩倩.动机性访谈在糖尿病患者自我效能与自我管理中的应用研究[D].华中科技大学,护理学,2013,硕士.
[15]郑自永.全数字B超诊断仪软件设计[D].浙江工业大学,2012.
[16]褚双明.关于在华外资零售企业的企业制度文化研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[17]郭欣欣.六自由度摇摆台运动控制算法研究[D].中国舰船研究院,武器系统与运用工程,2014,硕士.
[18]王姣.治理视野下中国地方政府间合作问题研究[D].东北师范大学,行政管理,2012,硕士.
[19]冯希波.基于脉冲变压器的触发系统研制[D].华中科技大学,高电压与绝缘技术,2013,硕士.
[20]彭前进.群落网络的同步特点研究[D].广西师范大学,理论物理,2013,硕士.
[21]王书宁,黄学俊,戴建设.线性模型参数l_∞和l_1中心估计量的统一求法[J].自动化学报,1996,03:353-356.
[22]徐梅梅.房地产上市公司股权结构与公司绩效关系研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[23]代丽丽.一类反应扩散系统的动力学性态[D].长春工业大学,应用数学,2013,硕士.
[24]胡云霞.PLGA/O-CMC抗癌药物及基因复合功能纳米载体系统的构建及评价[D].天津大学,材料学,2004,硕士.
[25]黄霄.MIMO SC-FDMA接收端检测算法研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[26]张玉芝.十六字令(四首)——祝贺《机械管理开发》杂志创刊10周年[J].机械管理开发.1996(02)
[27]周跃,张军,骆华松,徐强.松属、青冈属乔木侧根的强度在防护林固土护坡作用中的意义[J].植物生态学报,2001,01:105-109.
[28]杨娜娜.新中国成立后中国化马克思主义发展观研究[D].鲁东大学,马克思主义中国化,2014,硕士.
[29]傅小顺.警察形象营销式塑造[D].西南政法大学,警察科学,2012,硕士.
[30]刘青.网络时代下的爱国主义教育研究[D].河北师范大学,思想政治教育,2014,硕士.
[31]张敏芝.医院信息化建设研究[D].苏州大学,公共卫生（专业学位）,2012,硕士.
[32]孙捷.信息技术在竞争情报系统中的应用[D].华东师范大学,2004.
[33]潘仲友.重庆市北碚区体育旅游资源开发研究[D].西南大学,体育人文社会学,2014,硕士.
[34]全炳旭.气候变化对吉林省水稻延迟型低温冷害影响的研究[D].吉林农业大学,作物栽培学与耕作学,2012,硕士.
[35]李慧.地利集团全面预算管理体系设计[D].哈尔滨工业大学,会计学,2014,硕士.
[36]孟祥英.PDMS微芯片通道表面修饰方法及其在氨基酸分离分析中的应用研究[D].南昌大学,2012.
[37]纪江叶.视听线索对汉—英双语者语言转换的影响[D].河北大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[38]张方.1,3,5-噁二嗪与咔唑类杂环化合物的合成及其性能研究[D].宁夏大学,有机化学,2014,硕士.
[39]周莹.学生译员交传笔记的特征与困难[D].广东外语外贸大学,翻译学,2013,硕士.
[40]赵少伟.砌体结构基础下砂垫层隔震性能试验研究[D].河北工业大学,结构工程,2004,硕士.
[41]丰硕.当现代设计撞上自由创作[J].品牌(下半月),2014,11:85.
[42]吕承远.1000MW水轮发电机电磁损耗与热性能分析[D].哈尔滨理工大学,电机与电器,2012,硕士.
[43]靳军.墙式切圆燃烧冲蚀磨损与高温腐蚀的耦合作用研究[D].哈尔滨工业大学,热能工程,2014,硕士.
[44]焦湘恒,刘保华,王成礼,田召才.检验—VSP技术及其应用[J].石油地球物理勘探,1991,01:49-56+128.
[45]胡凌波,王波,鲍涛,计伟荣.非贵金属催化剂用于乳酸乙酯加氢制1,2-丙二醇[J].工业催化,2013,10:71-75.
[46]郑继平.计算机辅助液压实验数据采集及可视化分析系统的开发[D].武汉理工大学,机械电子工程,2004,硕士.
[47]王斐.企业人员招聘中的学历信号失真研究[D].西南大学,教育经济与管理,2014,硕士.
[48]宋承志.大型齿轮测量中心齿轮安装误差补偿技术研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2014,硕士.
[49]陈国峰.Intranet中IPv6过渡策略的研究与应用[D].杭州电子科技大学,计算机系统结构,2011,硕士.
[50]张锦.Internet环境下协同工作与数据挖掘研究[D].复旦大学,2004.